Vi beskriver anvendelsen af en stopped-flow instrument at undersøge både reduktive og oxidativ halve reaktioner<em> Aspergillus fumigatus</em> Siderofor A (Sida) et flavin-afhængigt monooxygenase. Vi derefter viser spektre, der svarer til de arter i reaktionen af Sida og vi beregne hastighedskonstanterne for deres dannelse.
Aspergillus fumigatus siderofor A (Sida) er en FAD-holdig monooxygenase, som katalyserer hydroxyleringen af ornithin i biosyntesen af hydroxamat siderophorer, der er væsentlige for virulens (f.eks ferricrocin eller N ', N ", N'''-triacetylfusarinine C) 1. reaktionen katalyseres af Sida kan opdeles i reduktive og oxidativ halve reaktioner (skema 1). reduktiv halv-reaktion, er det oxiderede FAD bundet til A f Sida, reduceres NADPH 2,3. i den oxidative halv-reaktion den reducerede cofaktor reagerer med molekylært oxygen til dannelse af en C4a-hydroperoxyflavin mellemprodukt, som overfører et oxygenatom til ornithin. Her beskriver vi en fremgangsmåde til måling af priser og påvise de forskellige spektrale former Sida anvendelse af en stopped-flow instrument installeret i en anaerob handskekasse. I stopped-flow instrument, er små volumener af reaktanter hurtigt blandet, og efter strømningen standses ved the stoppet sprøjte (figur 1), er de spektrale ændringer af opløsningen anbringes i den observation cellen optaget over tid. I den første del af forsøget viser vi, hvordan vi kan bruge stopped-flow instrument i single-mode, hvor den anaerobe reduktion af flavin i A f Sida af NADPH er direkte målt. Vi derefter anvende dobbelt blanding miljøer, hvor A f Sida først anaerobt reduceres med NADPH i en udpeget tidsperiode i et aldrende sløjfe, og omsættes derefter med molekylært oxygen i observation celle (figur 1). For at udføre dette forsøg, anaerobe buffere er nødvendigt, fordi når kun den reduktive halv-reaktionen overvåges, vil enhver oxygen i opløsningerne reagerer med den reducerede flavin-cofaktor og danner en C4a-hydroperoxyflavin mellemprodukt, som i sidste ende vil henfalde tilbage i den oxiderede flavin . Dette ville ikke tillade brugeren at måle nedsættelsessatser da der ville være fuldstændig omsætning EnzYme. Når den oxidative halv-reaktion blev undersøgt enzymet skal reduceres i fravær af oxygen, således at kun de trin mellem reduktion og oxidation observeres. En af de anvendte puffere i dette forsøg er oxygen mættet, således at vi kan studere oxidative halv-reaktion ved højere koncentrationer af oxygen. Det er ofte de, der er gennemført, når man studerer enten de reduktive eller oxidative halve reaktioner med flavin-holdige monooxygenases. Tidsskalaen for de forud steady-state eksperimenter udført med stopped-flow er millisekunder til sekund, som tillader bestemmelse af iboende hastighedskonstanter og påvisning og identifikation af mellemprodukter i reaktion 4. De her beskrevne procedurer kan anvendes til andre flavin-afhængigt monooxygenaser. 5,6
Enzymer, der katalyserer redoxreaktioner sædvanligvis indeholde cofaktorer såsom hæm'er og flaviner, der undergår væsentlig absorbansændringer under den katalytiske cyklus. Den oxiderede form af flavin viser absorbansen maksima ved ~ 360 og 450 nm, og reduktion er typisk overvåget ved at følge absorbansen fald ved 450 nm 7. I almindelighed er nogle forbigående mellemprodukter til stede, men form og forfald for hurtigt til at blive målt i regelmæssige spektrofotometre. Anvendelse af Applied Photophysics SX20 stopped-flow spektrofotometer (eller lignende instrumenter), er det muligt at måle absorbans ændringer i millisekund tidsskala (døde-tid, 2 ms). Her studerede de reduktive og oxidative halve reaktioner flavin-afhængige monooxygenase A f Sida, der tjener som model. Hastigheden af hydrid overførsel blev bestemt ved at måle ændringen i absorbans ved 452 nm efter tilsætningen af enzymet med NADPH under anaerobe betingelser. Efterfølgende under advantage af den dobbelte blande-mode af stopped-flow instrument blev enzymet først omsættes med NADPH, indtil fuldstændig reduktion blev opnået, derefter reduceret enzym-NADP +-kompleks blev blandet med oxygen. Efter denne procedure, er det muligt at detektere forbigående oxygenerede Flavin mellemprodukter og til at måle satser for dannelse og forfald. Identifikationen af disse mellemprodukter tilvejebringer eksperimentelle data om arten af de reagerende arter katalyse. I tilfælde af f Sida, dannelsen af C4a-hydroperoxyflavin (typisk overvåget ved 370-380 nm), hvilket er den hydroxylering arter. Desuden tillader måling af hastighedskonstanten for hvert trin at man opnår information om den hastighedsbestemmende trin af reaktionen og hjælpe til at belyse de kinetiske og kemiske mekanismer af enzymet.
I almindelighed kan tilsvarende fremgangsmåder kan anvendes til andre flavoenzymes eller proteiner som absorbansændringer forekom, såsom proteiner, contain hæm, pyridoxal-phosphat, eller ikke-hæm-jern 8-10. En begrænsning ved denne metode er, at store mængder af oprenset enzym er påkrævet, men dette kan overvindes ved anvendelse af et ekspressionssystem med høje udbytter. Man bestemmer den optimale proteinkoncentration til optagelse spektre ved anvendelse af nok protein, således at et stærkt signal kan observeres, men ikke for meget, så at enzymet ikke er spildt. Typisk den laveste enzymkoncentrationen for flavin-holdige enzymer, der anvendes i stopped-flow eksperimenter er 6-10 um (efter blanding) og bestemmes ved den tilsvarende molære ekstinktionskoefficient af enzymet. I tilfælde af f Sida, er procentdelen af enzymet er bundet FAD 50-65% 2. Apo-protein betragtes som inaktive i disse eksperimenter, fordi en bundet FAD cofaktor er nødvendig for katalyse. En anden mulig begrænsning ved denne metode er, hvis processer i en enzym forekommer hurtigere end 2 ms (dødtiden af stopped-flow), vil de ikke blive observeret, men there er rapporteret strategier, hvor satser kan nedsættes for at overvinde dette problem. Et eksempel på dette omfatter at anvende en høj NaCI-koncentration på reaktionen af en ferredoxin-NADP + reduktase 11. Vaskning af oxygen fra strømningskredsløb af stopped-flow er ofte en vanskelig trin i dette eksperiment, og kræver særlig opmærksomhed. Den glucoseoxidase-glucose er beskrevet her er anvendt med succes i de fleste laboratorier da det er en effektiv og billig fremgangsmåde. Der er imidlertid visse ulemper, som omfatter fremstilling af H2O 2 og til nogle anvendelser andre alternativer såsom protocatechuate dioxygenase-protocatechuate bør overvejes 12. Anvendelsen af en anaerob handskekasse gør det lettere at sikre anaerobe betingelser, men er ikke væsentligt. Oxygen skal fjernes fra strømningskredsløb af stopped-flow, som vi vil enzymet at blive reduceret i fravær af oxygen eller reagere med oxygen i en koncentrations, som vi angiver. Selv om den stopped-flow er i handskekassen, der er oxygen i strømningskredsløbet, hvis vi anvendt aerobe puffere i tidligere eksperimenter. Ud over absorbansmålinger, kan fluorescens og cirkulær dichroisme assays udføres i Applied Photophysics SX20 stopped-flow spektrofotometer med de tilsvarende tilbehør.
The authors have nothing to disclose.
Forskning støttet af NSF pris MCB-1.021.384.
General Laboratory Equipment | Company | Catalogue Number |
Vacuum pump | Welch | – |
Büchner flasks | Fisher | 70340-500 |
Stir bars | Fisher | 14-512-129 |
Stir plates | Fisher | 11-100-49S |
Schlenk lines | Kontes Glass | – |
Argon tank | Airgas | AR UPC300 |
Nitrogen tank | Airgas | NI200 |
Nitrogen tank, ultra high purity grade | Airgas | NI UHP200 |
Oxygen tank | Airgas | OX 40 |
5% Hydrogen balance nitrogen tank | Airgas | X02NI95B200H998 |
SX20 Stopped-flow spectrophotometer | AppliedPhotophysics | – |
Glove box | Coy | – |
Water bath | Brinkmann Lauda | – |
Supplies | ||
50 mL BD Falcon tubes | Fisher | 14-432-23 |
15 mL BD Falcon conical tubes | Fisher | 05-527-90 |
1.5 mL Eppendorf microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-18 |
50 and 25 mL glass vials | Fisher | 06-402 |
Rubber stoppers | Fisher | 06-447H |
Aluminum seals | Fisher | 06-406-15 |
Reagents | ||
Potassium phosphate, monobasic | Fisher | AC2714080025 |
Potassium phosphate, dibasic | Fisher | P288-500 |
Sodium acetate | Sigma | S-2889 |
Glucose oxidase from A. niger | Sigma | G7141-250KU |
D-Glucose | Fisher | D16-500 |
β-NADPH | Fisher | ICN10116783 |
L(+)-Ornithine hydrochloride | Fisher | ICN10116783 |