पीला रंग - निर्भर Monooxygenase reductive और ऑक्सीडेटिव आधा प्रतिक्रियाओं के निरीक्षण रूका फ्लो Spectrophotometry का उपयोग
Summary
हम एक साधन बंद कर दिया प्रवाह का उपयोग करने के लिए दोनों reductive और oxidative के आधे प्रतिक्रियाओं की जांच का वर्णन<em> Aspergillus fumigatus</emहै> siderophore (सीडा) एक, एक पीला रंग पर निर्भर monooxygenase. हम तो सीडा की प्रतिक्रिया में प्रजातियों के लिए इसी स्पेक्ट्रा दिखाते हैं और हम उनके गठन के लिए दर स्थिरांक की गणना.
Abstract
Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of hydroxamate siderophores that are essential for virulence (e.g. ferricrocin or N‘,N“,N”’-triacetylfusarinine C)1. The reaction catalyzed by SidA can be divided into reductive and oxidative half-reactions (Scheme 1). In the reductive half-reaction, the oxidized FAD bound to Af SidA, is reduced by NADPH2,3. In the oxidative half-reaction, the reduced cofactor reacts with molecular oxygen to form a C4a-hydroperoxyflavin intermediate, which transfers an oxygen atom to ornithine. Here, we describe a procedure to measure the rates and detect the different spectral forms of SidA using a stopped-flow instrument installed in an anaerobic glove box. In the stopped-flow instrument, small volumes of reactants are rapidly mixed, and after the flow is stopped by the stop syringe (Figure 1), the spectral changes of the solution placed in the observation cell are recorded over time. In the first part of the experiment, we show how we can use the stopped-flow instrument in single mode, where the anaerobic reduction of the flavin in Af SidA by NADPH is directly measured. We then use double mixing settings where Af SidA is first anaerobically reduced by NADPH for a designated period of time in an aging loop, and then reacted with molecular oxygen in the observation cell (Figure 1). In order to perform this experiment, anaerobic buffers are necessary because when only the reductive half-reaction is monitored, any oxygen in the solutions will react with the reduced flavin cofactor and form a C4a-hydroperoxyflavin intermediate that will ultimately decay back into the oxidized flavin. This would not allow the user to accurately measure rates of reduction since there would be complete turnover of the enzyme. When the oxidative half-reaction is being studied the enzyme must be reduced in the absence of oxygen so that just the steps between reduction and oxidation are observed. One of the buffers used in this experiment is oxygen saturated so that we can study the oxidative half-reaction at higher concentrations of oxygen. These are often the procedures carried out when studying either the reductive or oxidative half-reactions with flavin-containing monooxygenases. The time scale of the pre-steady-state experiments performed with the stopped-flow is milliseconds to seconds, which allow the determination of intrinsic rate constants and the detection and identification of intermediates in the reaction4. The procedures described here can be applied to other flavin-dependent monooxygenases.5,6
Protocol
Discussion
Redox प्रतिक्रियाओं उत्प्रेरित एंजाइमों कि आमतौर पर hemes और flavins कि उत्प्रेरक चक्र के दौरान महत्वपूर्ण absorbance के परिवर्तन से गुजरना जैसे cofactors होते हैं. पीला रंग का ऑक्सीकरण फार्म absorbance के मॅक्सिमा ~ 360 और 450 एनएम पर प्रस्तुत करता है, और इसकी कमी आम तौर पर 7 एनएम पर 450 absorbance के कमी के बाद से नजर रखी है. सामान्य में, कुछ क्षणिक मध्यवर्ती मौजूद है, लेकिन फार्म और क्षय भी नियमित spectrophotometers में मापा जा तेजी से कर रहे हैं. एप्लाइड Photophysics SX20 रोका प्रवाह स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (या इसी तरह के उपकरण) का उपयोग करना, यह संभव है absorbance के millisecond के समय के पैमाने में परिवर्तन (मृत समय, 2 एमएस) को मापने के. यहाँ हम पीला रंग पर निर्भर monooxygenase एक च सीडा reductive और oxidative आधा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन किया, एक मॉडल के रूप में सेवारत. hydride हस्तांतरण की दर anaerobic शर्तों के तहत एंजाइम NADPH साथ मिश्रण के बाद 452 एनएम absorbance के परिवर्तन को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था. बाद में, लाभ लेने केरोका साधन – प्रवाह की डबल मिश्रण मोड के ई, एंजाइम पहले NADPH साथ प्रतिक्रिया व्यक्त किया गया था, जब तक पूर्ण कमी हासिल की थी, तो कम एंजाइम NADP + जटिल ऑक्सीजन के साथ मिलाया गया था. इस प्रक्रिया के बाद, यह संभव है क्षणिक ऑक्सीजन पीला रंग मध्यवर्ती पता लगाने के लिए और गठन और क्षय की दर को मापने. इन मध्यवर्ती की पहचान कटैलिसीस प्रतिक्रिया प्रजातियों में से एक प्रकृति के बारे में प्रयोगात्मक डेटा प्रदान करता है. एक च सीडा, (आम तौर पर 370-380 एनएम पर निगरानी) C4a hydroperoxyflavin, जो hydroxylating प्रजातियों के गठन के मामले में. इसके अलावा, हर कदम की स्थिर दर को मापने के एक दर का निर्धारण प्रतिक्रिया के कदम के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए और मदद करने के लिए एंजाइम की गतिज और रासायनिक तंत्र स्पष्ट अनुमति देता है.
सामान्य में, समान दृष्टिकोण के अन्य flavoenzymes, या प्रोटीन जैसे प्रोटीन absorbance के जो परिवर्तन हुआ है, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि आगेऐन heme, pyridoxal फॉस्फेट, या गैर heme 8-10 लोहा. इस विधि के लिए एक सीमा है कि शुद्ध एंजाइम की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है, लेकिन यह उच्च पैदावार साथ एक अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके दूर किया जा सकता है. एक पर्याप्त प्रोटीन ताकि एक मजबूत पर्याप्त संकेत देखा जा सकता है का उपयोग करने के द्वारा रिकॉर्डिंग स्पेक्ट्रा के लिए इष्टतम प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करता है, लेकिन नहीं भी इतना है कि एंजाइम नहीं बर्बाद किया है. आमतौर पर, पीला रंग युक्त एंजाइमों रोका प्रवाह प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए सबसे कम एंजाइम एकाग्रता 6-10 माइक्रोन (मिश्रण बाद) है और इसी एंजाइम की दाढ़ विलुप्त होने गुणांक का उपयोग कर निर्धारित किया है. एक च सीडा के मामले में, एंजाइम बाध्य धुनी का प्रतिशत 50-65% 2 है. ए पी ओ प्रोटीन इन प्रयोगों में निष्क्रिय के रूप में माना जाता है क्योंकि एक ही धुनी cofactor के कटैलिसीस के लिए आवश्यक है. इस विधि के लिए एक और संभव सीमा तो एक एंजाइम की प्रक्रिया में होने पर 2 से तेजी से एमएस (रोका प्रवाह के मर समय) वे मनाया जा नहीं होगा, लेकिन वें हैअरे रणनीतियों जहां दर इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए कम किया जा सकता है रिपोर्ट कर रहे हैं. इस के लिए एक उदाहरण है एक ferredoxin – NADP + 11 रिडक्टेस की प्रतिक्रिया में एक उच्च NaCl एकाग्रता का उपयोग भी शामिल है. रोका प्रवाह के प्रवाह सर्किट से ऑक्सीजन की scrubbing के इस प्रयोग में अक्सर एक मुश्किल कदम है और विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है. ग्लूकोज oxidase ग्लूकोज यहाँ वर्णित प्रणाली को सफलतापूर्वक ज्यादातर प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है के रूप में यह एक प्रभावी और सस्ता तरीका है. हालांकि, वहाँ कुछ कमियां हैं जो 2 एच 2 हे के उत्पादन में शामिल हैं और कुछ अनुप्रयोगों के लिए protocatechuate प्रणाली रूप में dioxygenase – protocatechuate अन्य विकल्प 12 विचार किया जाना चाहिए रहे हैं. एक anaerobic दस्ताने बॉक्स का उपयोग anaerobic शर्तों को सुनिश्चित करने के लिए यह आसान बनाता है, लेकिन जरूरी नहीं है. ऑक्सीजन का प्रवाह बंद कर दिया प्रवाह सर्किट से हटा दिया जाना चाहिए के रूप में हम एंजाइम ऑक्सीजन के अभाव में कम करना चाहते हैं या एकाग्रता में ऑक्सीजन के साथ प्रतिक्रियाकि हम निर्दिष्ट. हालांकि बंद कर दिया प्रवाह दस्ताना बॉक्स में है, वहाँ प्रवाह सर्किट में ऑक्सीजन है अगर हम पिछले प्रयोगों में एरोबिक बफ़र्स का इस्तेमाल किया. Absorbance के माप के अलावा, प्रतिदीप्ति और परिपत्र द्विवर्णता assays इसी सामान के साथ एप्लाइड Photophysics SX20 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर रोका प्रवाह में प्रदर्शन किया जा सकता है.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NSF पुरस्कार MCB-1021384 अनुसंधान द्वारा समर्थित है.
Materials
| General Laboratory Equipment | Company | Catalogue Number |
| Vacuum pump | Welch | – |
| Büchner flasks | Fisher | 70340-500 |
| Stir bars | Fisher | 14-512-129 |
| Stir plates | Fisher | 11-100-49S |
| Schlenk lines | Kontes Glass | – |
| Argon tank | Airgas | AR UPC300 |
| Nitrogen tank | Airgas | NI200 |
| Nitrogen tank, ultra high purity grade | Airgas | NI UHP200 |
| Oxygen tank | Airgas | OX 40 |
| 5% Hydrogen balance nitrogen tank | Airgas | X02NI95B200H998 |
| SX20 Stopped-flow spectrophotometer | AppliedPhotophysics | – |
| Glove box | Coy | – |
| Water bath | Brinkmann Lauda | – |
| Supplies | ||
| 50 mL BD Falcon tubes | Fisher | 14-432-23 |
| 15 mL BD Falcon conical tubes | Fisher | 05-527-90 |
| 1.5 mL Eppendorf microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-18 |
| 50 and 25 mL glass vials | Fisher | 06-402 |
| Rubber stoppers | Fisher | 06-447H |
| Aluminum seals | Fisher | 06-406-15 |
| Reagents | ||
| Potassium phosphate, monobasic | Fisher | AC2714080025 |
| Potassium phosphate, dibasic | Fisher | P288-500 |
| Sodium acetate | Sigma | S-2889 |
| Glucose oxidase from A. niger | Sigma | G7141-250KU |
| D-Glucose | Fisher | D16-500 |
| β-NADPH | Fisher | ICN10116783 |
| L(+)-Ornithine hydrochloride | Fisher | ICN10116783 |
References
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