Beskriver vi användningen av en stoppat flöde instrument för att undersöka både reducerande och oxiderande halvreaktioner som<em> Aspergillus fumigatus</em> Siderofor A (Sida), en flavinberoende monooxygenas. Vi visar sedan spektra som motsvarar arten i reaktionen Sida och vi beräknar att hastighetskonstanterna för deras bildande.
Aspergillus fumigatus siderofor A (Sida) är en FAD-innehållande monooxygenas som katalyserar hydroxylering av ornitin i biosyntesen av hydroxamat sideroforer som är väsentliga för virulens (t.ex. ferricrocin eller N ', N ", N'''-triacetylfusarinine C) 1. den reaktion som katalyseras av Sida kan delas in i reduktiva och oxidativ halvreaktioner (Schema 1). I den reduktiva halv-reaktionen oxideras FAD bunden till A f Sida, reduceras med NADPH 2,3. I den oxidativa halv-reaktion den reducerade kofaktorn reagerar med molekylärt syre för att bilda en C4a-hydroperoxyflavin mellanliggande, som överför en syreatom till ornitin. Här beskriver vi ett förfarande för att mäta hastigheter och upptäcka de olika spektrala former av Sida med en stoppad flöde instrument installeras i en anaerob handskbox. I stoppat flöde instrumentet, små volymer av reaktanter blandas snabbt, och efter det att flödet stoppas genom: ee stopp spruta (figur 1), är de spektrala förändringarna av lösningen placerades i observationen cellen registrerades över tiden. I den första delen av experimentet visar vi hur vi kan använda den stoppade flöde instrument i samma läge, där den anaeroba minskningen av flavin i A f Sida NADPH är direkt mäts. Vi använder sedan dubbla blanda inställningarna där A f Sida först anaerobt minskas med NADPH under en bestämd tidsperiod i en åldrande slinga, och sedan reagera med molekylärt syre i observationen cellen (Figur 1). För att utföra detta experiment, anaeroba buffertar är nödvändiga eftersom bara den reduktiva halv-reaktionen övervakas, kommer något syre i lösningarna reagerar med den reducerade flavin kofaktor och bildar en C4a-hydroperoxyflavin intermediär som i slutändan kommer att sönderfalla tillbaka till den oxiderade flavin . Detta skulle inte tillåta användaren att exakt mäta nedsättningar eftersom det skulle vara komplett omsättning EnzYME. När den oxidativa halv-reaktionen studeras enzymet måste minskas i frånvaro av syre, så att bara de stegen mellan reduktion och oxidation observeras. En av de buffertar som används i detta experiment är syre mättades så att vi kan studera den oxidativa halv-reaktionen vid högre koncentrationer av syre. Det är ofta de tester som utfördes när man studerar antingen reduktiva eller oxidativ halva reaktioner med flavin innehåller monooxygenases. Den tidsskala pre-steady-state experiment utförda med stoppad-flödet är millisekunder till sekunder, som tillåter såväl fastställandet av inneboende hastighetskonstanter och upptäckt och identifiering av mellanprodukter i reaktionen 4. De förfaranden som beskrivs här kan appliceras på andra flavinberoende monooxygenases. 5,6
Enzymer som katalyserar redoxreaktioner innehåller vanligen kofaktorer såsom hemer och flaviner som undergår betydande absorbansförändringar under den katalytiska cykeln. Den oxiderade formen av flavin presenteras absorbansmaxima vid ~ 360 och 450 nm, och dess reduktion övervakas typiskt genom att följa absorbansen minskning vid 450 nm 7. I allmänhet vissa transienta mellanprodukter är närvarande men formen och sönderfall alltför snabb för att mätas i regelbundna spektrofotometrar. Användning av Applied Photophysics SX20 stoppat flöde spektrofotometer (eller liknande instrument), är det möjligt att mäta absorbansen förändringar i millisekunder skala (dödtid, 2 ms). Här har vi studerat de reduktiva och oxidativ halva reaktioner flavinberoende monooxygenas A f Sida, som fungerar som en modell. Hastigheten för hydridöverföring bestämdes genom att mäta förändringen av absorbansen vid 452 nm efter blandning av enzymet med NADPH under anaeroba betingelser. Därefter, med advantage av den dubbla blandningen läge för den stoppade flöde instrument var enzymet först reagera med NADPH, tills full reduktion uppnåddes, då den reducerade enzym-NADP + komplex blandades med syre. Efter denna procedur är det möjligt att upptäcka övergående syresatta Flavin intermediärer och att mäta andelen bildning och förfall. Identifieringen av dessa mellanprodukter ger experimentella data om vilken typ av de reagerande arter i katalys. I fallet med Af Sida, bildningen av C4a-hydroperoxyflavin (typiskt övervakas vid 370-380 nm), som är Med hydroxyleringsmedlet arter. Dessutom kan mätning av hastighetskonstanten för varje steg gör det möjligt att erhålla information om den hastighetsbestämmande steget av reaktionen och bidra till att belysa de kinetiska och kemiska mekanismer av enzymet.
I allmänhet kan liknande metoder användas för andra flavoenzymes eller proteiner för vilka absorbansförändringar uppstått, såsom proteiner som fortsain heme, pyridoxal-fosfat, eller icke-hemjäm 8-10. En begränsning med denna metod är att stora mängder av renat enzym erfordras, men detta kan övervinnas genom användning av en expressions-system med höga utbyten. Man bestämmer den optimala proteinkoncentrationen för inspelning spektra med användning av tillräckligt med protein för att en tillräckligt stark signal kan observeras, men inte alltför mycket, så att enzymet inte går till spillo. Typiskt är den lägsta enzymkoncentrationen för flavin-innehållande enzymer som används i stoppat flöde experiment 6-10 pM (efter blandning) och bestäms med användning av motsvarande molära extinktionskoefficienten av enzymet. I fallet med Af Sida, är procentandelen av det bundna enzymet FAD 50-65% 2. Apo-protein anses som inaktiv i dessa experiment eftersom en bunden FAD kofaktor är nödvändig för katalys. En annan möjlig begränsning med denna metod är, om processer i ett enzym inträffa snabbare än 2 ms (dödtid av stoppat flöde) kommer de inte att observeras, men teere redovisas strategier där priserna kan sänkas till lösa denna fråga. Ett exempel på detta innefattar användning av en hög NaCl-koncentration i reaktionsblandningen av en ferredoxin-NADP reduktas + 11. Den skrubbning av syre från strömningskretsen i stoppat flöde är ofta en besvärlig steg i detta experiment och kräver speciell uppmärksamhet. Glukosoxidas glukos-systemet som beskrivs här används med framgång i de flesta laboratorier eftersom det är en effektiv och billig metod. Det finns emellertid vissa nackdelar, vilka innefattar framställning av H 2 O 2 och för vissa tillämpningar andra alternativ såsom protocatechuate dioxygenas-protocatechuate bör övervägas 12. Användningen av en anaerob handskbox gör det lättare att säkerställa anaeroba betingelser, men är inte väsentligt. Syre måste avlägsnas från strömningskretsen i stoppat flöde som vi vill det enzym som skall reduceras i frånvaro av syre eller reagera med syre i en koncentrations som vi anger. Även om stoppade flöde finns i handskfacket finns syre i flödet kretsen om vi använde aeroba buffertar i tidigare experiment. Förutom absorbansmätningar kan fluorescens och cirkulär dikroism analyser utföras i Applied Photophysics SX20 stoppat flöde spektrofotometer med motsvarande tillbehör.
The authors have nothing to disclose.
Forskning som stöds av NSF utmärkelsen MCB-1.021.384.
General Laboratory Equipment | Company | Catalogue Number |
Vacuum pump | Welch | – |
Büchner flasks | Fisher | 70340-500 |
Stir bars | Fisher | 14-512-129 |
Stir plates | Fisher | 11-100-49S |
Schlenk lines | Kontes Glass | – |
Argon tank | Airgas | AR UPC300 |
Nitrogen tank | Airgas | NI200 |
Nitrogen tank, ultra high purity grade | Airgas | NI UHP200 |
Oxygen tank | Airgas | OX 40 |
5% Hydrogen balance nitrogen tank | Airgas | X02NI95B200H998 |
SX20 Stopped-flow spectrophotometer | AppliedPhotophysics | – |
Glove box | Coy | – |
Water bath | Brinkmann Lauda | – |
Supplies | ||
50 mL BD Falcon tubes | Fisher | 14-432-23 |
15 mL BD Falcon conical tubes | Fisher | 05-527-90 |
1.5 mL Eppendorf microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-18 |
50 and 25 mL glass vials | Fisher | 06-402 |
Rubber stoppers | Fisher | 06-447H |
Aluminum seals | Fisher | 06-406-15 |
Reagents | ||
Potassium phosphate, monobasic | Fisher | AC2714080025 |
Potassium phosphate, dibasic | Fisher | P288-500 |
Sodium acetate | Sigma | S-2889 |
Glucose oxidase from A. niger | Sigma | G7141-250KU |
D-Glucose | Fisher | D16-500 |
β-NADPH | Fisher | ICN10116783 |
L(+)-Ornithine hydrochloride | Fisher | ICN10116783 |