मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) GFP साथ रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग में दैहिक कोशिकाओं reprogramming
Summary
एक retrovirus मध्यस्थता Oct4 के अस्थानिक अभिव्यक्ति के माध्यम से मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) उत्पन्न विधि, Sox2 Klf4, और MYC वर्णित है. मानव iPSC GFP अभिव्यक्ति पर आधारित कालोनियों की पहचान के लिए एक व्यावहारिक रास्ता भी चर्चा की है.
Abstract
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) pluripotent और इन विट्रो रोग मॉडलिंग और 1 दवा पुनर्योजी में के लिए एक अमूल्य सेलुलर स्रोतों हैं. यह पहले से दिखाया गया है कि मानव कोशिकाओं दैहिक चार प्रतिलेखन कारक (Oct4, Sox2, Klf4 और Myc) के अस्थानिक अभिव्यक्ति के द्वारा pluripotency के लिए reprogrammed किया जा सकता है और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) हो गया 2-4. HESCs तरह, मानव IPSCs के pluripotent और ऑटोलॉगस कोशिकाओं के लिए एक संभावित स्रोत हैं. हम यहाँ के लिए चार reprogramming की GFP युक्त रेट्रोवायरल 4 रीढ़ में क्लोन कारकों के साथ मानव fibroblast कोशिकाओं reprogram करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन. निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम मानव ईएससी संस्कृति शर्त के तहत 3-4 सप्ताह में मानव IPSCs उत्पन्न करते हैं. मानव iPSC कालोनियों निकट morphology में hESCs और समान रेट्रोवायरल transgene मुंह बंद करने का एक परिणाम के के GFP प्रतिदीप्ति के नुकसान के रूप में प्रदर्शित. iPSC कालोनियों एक प्रतिदीप्ति microsco के तहत यंत्रवत् अलगपे hESCs के रूप में एक समान फैशन में व्यवहार करते हैं. इन कोशिकाओं में, हम एकाधिक के pluripotency जीन और सतह मार्कर की अभिव्यक्ति का पता लगाने.
Protocol
Discussion
चार प्रतिलेखन कारक reprograms IPSCs मानव fibroblasts की अभिव्यक्ति. मानव गैर एकीकृत या गैर आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए चिकित्सकीय सुरक्षित IPSCs उत्पन्न IPSCs उत्पन्न करने के लिए कई प्रयास किए गए थे. अब तक, इन विधि?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम और चार्ल्स हूड फाउंडेशन से बाल स्वास्थ्य अनुसंधान पुरस्कार मेडिसिन के येल स्कूल द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
| hESC medium | |||
| DMEM/F12 | 80% | Invitrogen | 11330057 |
| Knockout Serum Replacer | 20% | Invitrogen | 10828-028 |
| L-Glutamine (200 mM) | 2 mM | Invitrogen | 25030081 |
| Nonessential Amino Acids (10 mM) | 0.1 mM | Invitrogen | 11140050 |
| β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG | 0.1 mM | Invitrogen | M-6250 |
| bFGF-2 10 μg/ml | 4 ng/ml | GIBCO/BRL | GF003AF |
| Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
| Fiboblasts Medium | |||
| DMEM | 90% | Invitrogen | 11965118 |
| FBS | 10% | Invitrogen | 10407028 |
| Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Table 1. Culture Medium
| Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
| Antibodies | |||
| OCT4 | 1:500 | Abcam | Ab19857 |
| SSEA3 | 1:100 | Milipore | MAB4303 |
| SSEA4 | 1:100 | BD Biosciences | BD560218 |
| Tra-1-81 | 1:100 | BD Biosciences | BD560173 |
| Tra-1-60 | 1:100 | BD Biosciences | BD560174 |
| NANOG | 1:500 | Abcam | Ab21624 |
| Alexa-Flur 488 | 1:1000 | Invitrogen | A11008 |
| Alexa-Flur 555 | 1:1000 | Invitrogen | A21422 |
| DAPI | 1:5000 | Invitrogen | D1306 |
| Plasmids | |||
| pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
| pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
| pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
| pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
| Other Materials | |||
| Collagenase type IV | 1mg/ml | Invitrogen | 17104019 |
| Gelatin, Porcine | 0.1% | Sigma | G 1890 |
| Triton | 0.2% | Sigma | X100-500ML |
| Paraformaldehyde | 4% | Sigma | 47608 |
| BSA | 3% | American Bioanalytical | AB01800 |
| MEF feeder cells | Millipore | PMEF-N | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Equipment | |||
| Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter | |||
Table 2. Reagents and equipment.
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