Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas
Summary
Uma busca fundamentais em biologia celular é definir os mecanismos subjacentes à identidade dos organelos que tornam as células eucarióticas. Aqui é proposto um método para identificar os genes responsáveis pela integridade morfológica e funcional de organelas vegetais utilizando microscopia de fluorescência e as ferramentas a próxima geração de sequenciação.
Abstract
Este protocolo descreve um rastreio microscópio de fluorescência baseada de plântulas de Arabidopsis e descreve como mapear mutações recessivas que alteram a distribuição subcelular de um marcador específico marcado fluorescente na via secretora. Arabidopsis é um poderoso modelo biológico para estudos genéticos devido ao seu tamanho de genoma, tempo de geração e conservação de mecanismos moleculares entre os reinos. A matriz de genotipagem como uma abordagem para mapear a mutação em alternativa ao método tradicional baseado em marcadores moleculares é vantajosa porque é relativamente rápido e pode permitir que o mapeamento de vários mutantes de um período de tempo muito curto. Este método permite a identificação de proteínas que podem influenciar a integridade de qualquer organela em plantas. Aqui, como um exemplo, é proposto um ecrã para mapear genes importantes para a integridade do retículo endoplasmático (RE). Nossa abordagem, no entanto, pode ser facilmente estendido para outras organelas celulares vegetais(Por exemplo, ver 1,2), e, portanto, representa um passo importante para compreender a base molecular que regula outras estruturas subcelulares.
Protocol
Discussion
Aqui, foi descrito um rastreio de microscopia confocal baseado na identificação de mutantes endomembrane. Esta abordagem pode ser facilmente adaptado para outras organelas da célula para os quais marcadores específicos de proteínas fluorescentes estão disponíveis. A tela é baseado na identificação de mutantes que mostram uma distribuição aberrante do marcador fluorescente, quer na organela alvo ou para organelas que não são supostos para conter o marcador. Respectivamente, estes mutantes representam popula…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o apoio da Ciência Química, Geociências e Biociências Divisão, Escritório de ciências básicas da energia, Secretaria de Ciência, Departamento de Energia dos EUA (número prêmio DE-FG02-91ER20021) e National Science Foundation (MCB 0.948.584) (FB). Somos gratos à Sra. Karen Pássaro para a edição do manuscrito.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma | M0880 |
| NaOH | J.T Baker | 3722-05 |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 |
| Phytagel | Sigma | P8169-1Kg |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre | MPP92100 |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 |
| Alcohol 200 proof | Decan laboratories inc. | 2716 |
| NaOAc | J.T Baker | |
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 |
| Falcon tubes 50 mL | corning | 430290 |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | ||
| Filter paper 90mm | Whatman | 1001090 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo AB54-S | n.a |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph polymax 1040 | n.a |
| Centrifuge | Eppendorf 5417-R | n.a |
References
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