Fluorescence microscopie dépistage et séquençage de prochaine génération: des outils utiles pour l'identification des gènes impliqués dans des organites intégrité

Résumé

Une quête fondamentale en biologie cellulaire est de définir les mécanismes qui sous-tendent l'identité des organites qui rendent les cellules eucaryotes. Nous proposons ici une méthode pour identifier les gènes responsables de l'intégrité morphologique et fonctionnelle des organites de plantes en utilisant la microscopie à fluorescence et des outils de séquençage de prochaine génération.

Résumé

Ce protocole décrit une microscope à fluorescence sur le dépistage des plants d'Arabidopsis et décrit comment cartographier des mutations récessives qui modifient la distribution subcellulaire d'un marqueur fluorescent spécifique marqué dans la voie de sécrétion. Arabidopsis est un puissant modèle biologique pour les études génétiques en raison de sa taille du génome, temps de génération, et la conservation des mécanismes moléculaires chez les royaumes. Le tableau génotypage comme une approche à la carte de la mutation en alternative à la méthode traditionnelle basée sur des marqueurs moléculaires est avantageuse car elle est relativement rapide et peut permettre à la cartographie de plusieurs mutants dans un laps de temps très court. Cette méthode permet l'identification des protéines qui peuvent influer sur l'intégrité de tout organite dans les plantes. Ici, comme un exemple, nous proposons un écran pour cartographier les gènes importants pour l'intégrité du réticulum endoplasmique (RE). Notre approche, toutefois, peut être facilement étendu à d'autres organites des cellules végétales(Voir par exemple ^1,2), et représente donc une étape importante vers la compréhension de la base moléculaire qui régit d'autres structures subcellulaires.

Protocole

1. EMS traitement

Graines d'Arabidopsis thaliana sont mutagenèse utilisant comme agent de mutagène méthanesulfonate d'éthyle (EMS) ^3,4, ce qui induit dans le génome de C-à-T changements qui en résultent en C / G à T / A mutations ^5-7.

1. Peser 0,8 g de graines d'Arabidopsis (~ 40,000 graines) portant le marqueur fluorescent organite (plus précisément, dans cette étude ssGFPHDEL (séquence signal-GFP-HDEL tétrapeptide) a été utilisée comme un marqueur ER).
2. Transférer les graines dans un tube de 50 ml faucon, puis ajouter 25 ml d'eau distillée.
3. Ajouter 0,2% (v / v) mé....

Discussion

Ici, nous décrit une microscopie confocale d'un dépistage pour l'identification des mutants endomembranaire. Cette approche peut être facilement étendu pour d'autres organites de la cellule pour laquelle des marqueurs spécifiques de protéines fluorescentes sont disponibles. L'écran est basée sur l'identification de mutants qui montrent une répartition aberrante du marqueur fluorescent, soit dans l'organite cible ou à organites qui ne sont pas censé contenir le marqueur. Respectivement, ces mutant.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
Sulfonate éthylméthane	Sigma	M0880
NaOH	JT Baker	3722-05
Murashige Skoog basales moyennes w Gamborg vitamines	Phyto technolog Laboratorie	M404
Phytagel	Sigma	P8169-1 kg
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Maître pur de feuille d'usine de purification de l'ADN kit	Epicentre	MPP92100
Bioprime système d'étiquetage d'ADN	Invitrogen	18094-011
Alcool 200 Proof	Decan laboratoires inc.	2716
NaOAc	JT Baker
ATH1 Arabidopsis Gene pucetableau génome	Affymetrix	900385
Tubes Falcon 50 ml	Corning	430290
Tubes Eppendorf de 1,5 ml
Le papier-filtre 90mm	Whatman	1001090
Balance analytique	Mettler Toledo AB54-S	na
Nutation (vague) agitateur	Heidolph POLYMAX 1040	na
Centrifuger	Eppendorf 5417-R	na