Cholesterol efflux Assay
Summary
De cholesterol test is ontworpen om de snelheid van cholesterol efflux uit gekweekte cellen en de capaciteit van plasma acceptoren cholesterol afgegeven door de cellen te accepteren kwantificeren. De test bestaat uit het etiketteren van cellen met cholesterol, evenwicht van cholesterol tussen de intracellulaire zwembaden en het vrijgeven van cholesterol aan een extracellulaire acceptor.
Abstract
Cholesterolgehalte van cellen moet binnen de zeer nauwe grenzen te veel ofte weinig cholesterol in een cel resulteert in ontwrichting van cellulaire membranen, apoptose en necrose 1. Cellen kunnen de bron cholesterol uit intracellulaire synthese en uit plasma lipoproteïnen, beide bronnen voldoende zijn om volledig te voldoen aan cellen 'voor cholesterol. De processen van cholesterol synthese en opname wordt strak gereguleerd en tekortkomingen van cholesterol zijn zeldzaam 2. Te veel cholesterol komt vaker voor probleem 3. Met uitzondering van hepatocyten en enigszins bijnierschors, cellen niet kunnen cholesterol breken. Cellen hebben twee opties om hun cholesterol te verlagen: het cholesterol om te zetten in cholesterylesters, een optie met een beperkte capaciteit als overbelasting van cellen met cholesterylesters is ook giftig, en cholesterol efflux, een optie met potentieel onbeperkte capaciteit. Cholesterol efflux is een specIFIC proces dat wordt gereguleerd door een aantal intracellulaire vervoerders, zoals de ATP-bindende cassette transporter eiwitten A1 (ABCA1) en G1 (ABCG1) en scavenger receptor type B1. De natuurlijke acceptor van cholesterol in het plasma is high density lipoproteïne (HDL) en apolipoproteïne AI.
De cholesterol efflux test is ontworpen om de snelheid van cholesterol efflux uit gekweekte cellen te kwantificeren. Het meet het vermogen van cellen te handhaven cholesterol efflux en / of de capaciteit van plasma acceptoren cholesterol afgegeven door de cellen te accepteren. De test bestaat uit de volgende stappen. Stap 1: etiketteren van cellulaire cholesterol door het toevoegen van het label cholesterol aan serum-bevattend medium en incubatie met cellen voor 24-48 uur. Deze stap kan worden gecombineerd met het laden van cellen met cholesterol. Stap 2: incuberen van cellen in serum-vrij medium gelabelde cholesterol evenwicht tussen alle intracellulair cholesterol zwembaden. Deze fase kan worden gecombineerd met activering van cellulaire lolesterol transporteurs. Stap 3: incuberen van cellen met extracellulaire acceptor en kwantificering van beweging van gelabelde cholesterol uit cellen van de acceptor. Als cholesterolprecursors werden gebruikt om cholesterol nieuw gesynthetiseerde label, een vierde stap, zuivering van cholesterol, nodig zijn.
De test levert de volgende informatie: (i) hoe een bepaalde behandeling (een mutatie, een knock-down, een overexpressie of een behandeling) de capaciteit van de cel invloed op cholesterol efflux en (ii) hoe de capaciteit van de plasma-acceptoren te accepteren cholesterol wordt beïnvloed door een ziekte of een behandeling. Deze methode wordt vaak gebruikt in de context van cardiovasculair onderzoek, metabole en neurodegeneratieve aandoeningen, infectieziekten en reproductieve ziekten.
Protocol
Discussion
De beschreven methode om cholesterol efflux te meten is ontwikkeld om beweging van cholesterol te meten van de cellen een extracellulaire cholesterol acceptor. Er zijn verschillende kritische beschouwingen bij het begrijpen van deze methodologie.
Etikettering en evenwicht
In de beschreven methode gemerkte cholesterol wordt toegevoegd serum bevattend serum. Hoewel niet in detail onderzocht, wordt aangenomen dat cholesterol wordt opgenomen in serum lipoproteïnen en w…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van National Health en Medical Research Council van Australië (NHMRC) (526.615 en 545.906) en deels door OIS de Victoriaanse regering. DS is een fellow van NHMRC.
Materials
| ReagentsCells | HeLa | THP-1 | RAW | HUVEC | BHK-21 | HFF |
| Complete Media | RPMI – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 5% FCS – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
|||
| Serum Free Media | RPMI – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
|||
| Passage Method | 1 x Trypsin | Suspension | Scrape | 1 x Trypsin | ||
| Passage Ratio | 3:10 | 1:3 | 1:20 | 1:3 | 1:3 | |
| Cell Activation (optional) | TO-901317 – LXR-agonist – Final conc. 4 μM |
|||||
| Other Reagents | phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) – Cell differentiation – Final conc. 0.1μg/ml |
|||||
References
- Tabas, I. Cholesterol in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. Cholesterol feedback: from Schoenheimer’s bottle to Scap’s MELADL. J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).
- Tabas, I. Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications. J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).
- Murphy, A. J. High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).
- Mujawar, Z. Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages. PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).
- Patel, S. Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes. J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Shaw, J. A. Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque. Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).
- Kekulawala, R. J. Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality. Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).
- D’Souza, W. Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein. Circ. Res. 107, 217-227 (2010).
- Tchoua, U. The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport. Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).
- Mukhamedova, N. Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo. J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).
- Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux. Biochimie. 46, 9388-9398 (2007).
- Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae. Biochem. J. 358, 79-86 (2001).
- Smyth, I. A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis. PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).
- Fu, Y. Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells. J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).
- Calkin, A. C. Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux. Circulation. 120, 2095-2104 (2009).
