Kolesterol effluks Assay

Summary

Den kolesterol analysen er konstruert for å quantitate frekvensen av kolesterol utstrømming fra dyrkede celler og kapasitet på plasma akseptorer å akseptere kolesterol løslatt fra celler. Analysen består av merking celler med kolesterol, likevekt av kolesterol blant intracellulære bassenger og frigjøring av kolesterol til en ekstracellulær akseptor.

Abstract

Kolesterol innhold av celler må opprettholdes innenfor svært trange rammer, for mye eller for lite kolesterol i en celle resulterer i forstyrrelser av cellemembraner, apoptose og nekrose ^en. Celler kan kilde kolesterol fra intracellulær syntese og fra plasma lipoproteiner, begge kildene er tilstrekkelig til å tilfredsstille cellenes behov for kolesterol. Prosessene av kolesterol syntese og opptak er tett regulert og mangler av kolesterol er sjeldne ^to. Overdreven kolesterol er mer vanlig problem ^3. Med unntak av hepatocytter og i noen grad adrenokortikal celler, celler ikke klarer å fornedre kolesterol. Celler har to alternativer for å redusere sitt kolesterol innhold: å konvertere kolesterol til kolesteryl estere, et alternativ med begrenset kapasitet som overbelastning celler med kolesteryl estere er også giftig, og kolesterol utstrømming, et alternativ med potensielt ubegrenset kapasitet. Utstrømming av kolesterol er en specific prosess som er regulert av en rekke intracellulære transportører, slik som ATP bindende kassett Transporter proteiner A1 (ABCA1) og G1 (ABCG1) og scavenger reseptor type B1. Den naturlige akseptor av kolesterol i plasma er høy density lipoprotein (HDL) og apolipoprotein AI.

Den kolesterol utstrømming analysen er utformet for å quantitate frekvensen av kolesterol utstrømming fra dyrkede celler. Den måler antall celler til å opprettholde kolesterol utstrømming og / eller evne plasma akseptorer å akseptere kolesterol løslatt fra celler. Analysen består av følgende trinn. Trinn 1: merking cellulær kolesterol ved å legge merket kolesterol til serum-holdig medium og ruger med celler i 24-48 timer. Dette trinnet kan kombineres med lasting av celler med kolesterol. Trinn 2: inkubering av celler i serum-fri medium skal stabilisere merket kolesterol blant alle intracellulære kolesterol bassenger. Dette stadiet kan kombineres med aktivering av mobilnettet lmolesterol transportører. Trinn 3: inkubering av celler med ekstracellulært akseptor og kvantifisering av bevegelse av merket kolesterol fra cellene til akseptor. Dersom kolesterol forløpere ble brukt til å merke nylig syntetisert kolesterol, et fjerde trinn, rensing av kolesterol, kan kreves.

Analysen gir følgende informasjon: (i) hvordan en bestemt behandling (en mutasjon, en knock-down, en overuttrykk eller en behandling) påvirker kapasiteten til cellen for å efflux kolesterol og (ii) hvordan kapasiteten til plasma akseptorer å akseptere kolesterol påvirkes av en sykdom eller en behandling. Denne metoden er ofte brukt i sammenheng med kardiovaskulær forskning, metabolske og nevrodegenerative lidelser, smittsomme og reproduktive sykdommer.

Protocol

1. Utarbeidelse av [3 H]-kolesterol I avtrekksskap, dispensere den nødvendige mengden av [3 H] kolesterol inn i en 1,5 ml microfuge tube (0,5 μCi (19 kBq) per brønn er nødvendig for en typisk analyse). Hvis [3 H]-Kolesterol er suspendert i toluen, tørke den helt ned med N2 gass og resuspender med 100% etanol til en endelig konsentrasjon på 1 μCi (37 kBq / mL. Vortex og bland godt. 2. Kontaktflate Cells og merking Cellular Koles…

Discussion

Den beskrives metode for å måle kolesterol utstrømming er laget for å måle bevegelse av kolesterol fra cellene til en ekstracellulær kolesterol akseptor. Det er flere kritiske betraktninger i å forstå denne metoden.

Merking og likevekt

I den beskrevne metodikken merkede kolesterol legges til serum-holdig serum. Selv aldri undersøkt i detalj, er det antatt at kolesterol er innarbeidet i serum lipoproteiner og de er tatt opp av cellene. Det er viktig å gi ti…

Materials

ReagentsCells	HeLa	THP-1	RAW	HUVEC	BHK-21	HFF
Complete Media	RPMI – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep			M199 – 5% FCS – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS)	DMEM – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep
Serum Free Media	RPMI – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep			M199 – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS)	DMEM – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep
Passage Method	1 x Trypsin	Suspension	Scrape	1 x Trypsin
Passage Ratio	3:10	1:3		1:20	1:3	1:3
Cell Activation (optional)		TO-901317 – LXR-agonist – Final conc. 4 μM
Other Reagents		phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) – Cell differentiation – Final conc. 0.1μg/ml