Summary
O ensaio de colesterol é concebido para quantificar a taxa de efluxo de colesterol a partir de células cultivadas e da capacidade de plasma aceitadores para aceitar o colesterol libertado a partir de células. O ensaio consiste de marcação das células com o equilíbrio do colesterol, de colesterol entre pools intracelulares e libertação de colesterol para um aceitador extracelular.
Abstract
Teor de colesterol de células deve ser mantida dentro dos limites muito apertados, muito ou pouco colesterol em alguns resultados de células em ruptura das membranas celulares, a apoptose e necrose 1. As células podem colesterol fonte da síntese intracelular e de lipoproteínas plasmáticas, ambas as fontes são suficientes para satisfazer plenamente as necessidades de células para o colesterol. Os processos de síntese de colesterol e absorção são fortemente regulados e deficiências de colesterol são 2 raro. Excesso de colesterol é de 3 problema mais comum. Com a excepção dos hepatócitos e para algumas células grau adrenocorticais, as células são incapazes de degradar o colesterol. As células têm duas opções para reduzir seu teor de colesterol: para converter colesterol em ésteres de colesterol, uma opção com capacidade limitada como sobrecarga células com ésteres de colesterol também é tóxico, e efluxo do colesterol, uma opção com capacidade potencialmente ilimitado. Efluxo do colesterol é uma especificaçãoprocesso ific que é regulada por uma série de transportadores intracelulares, tais como ligação de ATP cassete transportador proteínas A1 (ABCA1) e G1 (ABCG1) e B1 eliminador de tipo de receptor. O aceitador de natural de colesterol no plasma é de lipoproteína de alta densidade (HDL) e da apolipoproteína AI.
O ensaio de efluxo de colesterol é concebido para quantificar a taxa de efluxo de colesterol a partir de células cultivadas. Mede a capacidade das células para manter o efluxo de colesterol e / ou a capacidade de plasma aceitadores para aceitar o colesterol libertado a partir de células. O ensaio consiste nos passos seguintes. Passo 1: etiquetagem colesterol celular por adição de colesterol rotulados para meio contendo soro e incubando com células de 24-48 h. Este passo pode ser combinado com o carregamento de células com colesterol. Passo 2: a incubação das células em meio isento de soro para equilibrar o colesterol marcado entre todos os pools de colesterol intracelular. Esta fase pode ser combinado com a activação do celular CHtransportadores olesterol. Passo 3: a incubação de células com aceitador extracelular e quantificação de movimento do colesterol a partir de células marcadas para o aceitador. Se precursores de colesterol foram utilizados para etiquetar o colesterol recém-sintetizado, um quarto passo, a purificação do colesterol, pode ser necessária.
O ensaio proporciona a seguinte informação: (i) como um tratamento particular (uma mutação, um knock-baixo, a superexpressão um ou um tratamento) afecta a capacidade da célula para o colesterol de efluxo e (ii) como a capacidade de aceitadores de plasma para aceitar o colesterol é afectada por uma doença ou um tratamento. Este método é geralmente usado no contexto de pesquisas cardiovasculares, doenças metabólicas e neurodegenerativas, infecciosas e doenças reprodutivas.
Protocol
Discussion
O método descrito para medir o efluxo de colesterol é concebido para medir o movimento do colesterol a partir de células de um aceitador de colesterol extracelular. Há várias considerações críticas na compreensão desta metodologia.
Rotulagem e de equilíbrio
Na metodologia descrita colesterol marcado é adicionado ao soro contendo soro. Embora nunca investigada em detalhe, presume-se que o colesterol é incorporado nas lipoproteínas do soro e são absorvid…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi suportado por concessões do National Saúde e Pesquisa Médica do Conselho da Austrália (NHMRC) (526.615 e 545.906) e em parte pelo Programa do Governo de Victoria da OIS. DS é um companheiro de NHMRC.
Materials
| ReagentsCells | HeLa | THP-1 | RAW | HUVEC | BHK-21 | HFF |
| Complete Media | RPMI – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 5% FCS – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
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| Serum Free Media | RPMI – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
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| Passage Method | 1 x Trypsin | Suspension | Scrape | 1 x Trypsin | ||
| Passage Ratio | 3:10 | 1:3 | 1:20 | 1:3 | 1:3 | |
| Cell Activation (optional) | TO-901317 – LXR-agonist – Final conc. 4 μM |
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| Other Reagents | phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) – Cell differentiation – Final conc. 0.1μg/ml |
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References
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