Ensayo de eflujo de colesterol
Summary
El ensayo de colesterol está diseñado para cuantificar la tasa de eflujo de colesterol a partir de células cultivadas y la capacidad de plasma aceptores para aceptar el colesterol liberado de las células. El ensayo consiste en el etiquetado de las células con el colesterol, equilibración de colesterol entre piscinas intracelulares y la liberación de colesterol a un aceptor extracelular.
Abstract
El contenido de colesterol de las células deben mantenerse dentro de los límites muy estrechos, demasiado o demasiado poco de colesterol en unos resultados de células en la interrupción de las membranas celulares, la apoptosis y necrosis 1. Las células pueden colesterol fuente de la síntesis intracelular y de las lipoproteínas del plasma, ambas fuentes son suficientes para satisfacer plenamente las necesidades de células para el colesterol. Los procesos de la síntesis de colesterol y el consumo están fuertemente regulados y las deficiencias de colesterol son poco frecuentes 2. El exceso de colesterol es de 3 problema más común. Con la excepción de los hepatocitos y algunas células adrenocorticales grado, las células son incapaces de degradar el colesterol. Las células tienen dos opciones para reducir su contenido de colesterol: para convertir el colesterol en ésteres de colesterol, una opción con una capacidad limitada, como la sobrecarga de las células con ésteres de colesterol también es tóxico, y el eflujo de colesterol, una opción con la capacidad potencialmente ilimitada. Eflujo de colesterol es una especificaciónproceso de IFIC que está regulada por una serie de transportadores intracelulares, como el ATP vinculante cassette transportista proteínas A1 (ABCA1) y G1 (ABCG1) y B1 del receptor scavenger tipo. El aceptador natural de colesterol en plasma es de lipoproteína de alta densidad (HDL) y apolipoproteína AI.
El ensayo de eflujo de colesterol está diseñado para cuantificar la tasa de eflujo de colesterol a partir de células cultivadas. Se mide la capacidad de las células para mantener el eflujo de colesterol y / o la capacidad de plasma aceptores para aceptar el colesterol liberado de las células. El ensayo consiste en los pasos siguientes. Paso 1: etiquetado colesterol celular mediante la adición de colesterol marcado a medio que contenía suero e incubando con células durante 24-48 h. Este paso puede ser combinado con la carga de las células con el colesterol. Paso 2: incubación de las células en medio libre de suero que se equilibre el colesterol marcado entre todos los grupos de colesterol intracelular. Esta etapa puede ser combinado con la activación de celular CHtransportistas olesterol. Paso 3: incubación de las células con aceptor extracelular y cuantificación de movimiento de colesterol marcado de las células al aceptor. Si los precursores de colesterol se utiliza para etiquetar el colesterol recién sintetizado, un cuarto paso, la purificación de colesterol, puede ser requerido.
El ensayo proporciona la siguiente información: (i) cómo un tratamiento particular (una mutación, un derribo, la sobreexpresión de una o de un tratamiento) afecta a la capacidad de las células con el colesterol flujo de salida y (ii) cómo la capacidad de los aceptantes de plasma para aceptar el colesterol se ve afectada por una enfermedad o un tratamiento. Este método se utiliza a menudo en el contexto de la investigación cardiovascular, enfermedades metabólicas y neurodegenerativas, infecciosas y enfermedades reproductivas.
Protocol
Discussion
El método descrito para medir el eflujo de colesterol está diseñado para medir el movimiento de colesterol de las células a un aceptor de colesterol extracelular. Hay varias consideraciones importantes en la comprensión de esta metodología.
Etiquetado y el equilibrio
En la metodología descrita colesterol marcado se añadieron al suero que contiene suero. Aunque nunca investigado en detalle, se supone que el colesterol se incorpora en las lipoproteínas de sue…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de Nacional de Salud y el Consejo de Investigación Médica de Australia (NHMRC) (526.615 y 545.906) y en parte por el Programa del Gobierno de Victoria OIS. DS es un compañero de NHMRC.
Materials
| ReagentsCells | HeLa | THP-1 | RAW | HUVEC | BHK-21 | HFF |
| Complete Media | RPMI – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 5% FCS – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
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| Serum Free Media | RPMI – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
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| Passage Method | 1 x Trypsin | Suspension | Scrape | 1 x Trypsin | ||
| Passage Ratio | 3:10 | 1:3 | 1:20 | 1:3 | 1:3 | |
| Cell Activation (optional) | TO-901317 – LXR-agonist – Final conc. 4 μM |
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| Other Reagents | phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) – Cell differentiation – Final conc. 0.1μg/ml |
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References
- Tabas, I. Cholesterol in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. Cholesterol feedback: from Schoenheimer’s bottle to Scap’s MELADL. J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).
- Tabas, I. Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications. J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).
- Murphy, A. J. High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).
- Mujawar, Z. Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages. PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).
- Patel, S. Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes. J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Shaw, J. A. Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque. Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).
- Kekulawala, R. J. Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality. Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).
- D’Souza, W. Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein. Circ. Res. 107, 217-227 (2010).
- Tchoua, U. The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport. Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).
- Mukhamedova, N. Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo. J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).
- Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux. Biochimie. 46, 9388-9398 (2007).
- Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae. Biochem. J. 358, 79-86 (2001).
- Smyth, I. A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis. PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).
- Fu, Y. Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells. J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).
- Calkin, A. C. Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux. Circulation. 120, 2095-2104 (2009).
