Primære Mikroglia Isolering af blandede gliacelle Kulturer af neonatal rottehjerne Tissue
Summary
Isolering primære microglia fra cellulær heterogenicitet i hjernen er vigtigt at undersøge deres rolle i både fysiologiske og patologiske tilstande. Denne protokol beskrives en mekanisk isolation og blandet cellekultur teknik, som tilvejebringer et højt udbytte og høj renhed, levedygtige primære mikrogliaceller celler til<em> In vitro</em> Studie-og downstream-applikationer.
Abstract
Microglia udgør ca 12% af den totale cellepopulation i pattedyrhjernen. Mens neuroner og astrocytter betragtes de primære celletyper i nervesystemet, microglia spiller en væsentlig rolle i normal hjerne fysiologi ved overvågning væv for snavs og patogener, og opretholdelse af homeostase i parenchymet via fagocytisk aktivitet 1,2. Mikroglia aktiveres i løbet af en række skader og sygdomme, herunder neurodegenerative sygdomme, traumatisk hjerneskade, og nervesystemet infektion 3. Under disse aktiverende betingelser øger microglia deres fagocytiske aktivitet, underkastes morpohological og proliferativ ændringer og aktivt udskiller reaktive oxygen-og nitrogenforbindelser, pro-inflammatoriske kemokiner og cytokiner, der ofte aktivere en parakrin eller autokrin sløjfe 4-6. Da disse microgliale reaktioner bidrager til sygdom patogenese i neurologiske lidelser, forskning fokuseret på microglia er berettiget.
På grund af cellulær heterogenicitet i hjernen, er det teknisk vanskeligt at opnå tilstrækkelig mikroglial prøvematerialet med høj renhed under de vivo-forsøg. Aktuel forskning i de neuroprotektive og neurotoksiske funktioner mikroglia kræver en rutinemæssig teknisk metode til konsekvent at generere ren og sund mikroglia med tilstrækkelig udbytte for at studere. Vi præsenterer i tekst og video, en protokol til at isolere rene primære mikroglia fra blandede glia kulturer til en række af downstream applikationer. Kort fortalt denne teknik anvender dissocieret hjernevæv fra neonatale rotteunger at fremstille blandede glia-cellekulturer. Efter de blandede glia kulturerne når konfluens, er primære microglia mekanisk isoleret fra kulturen ved en kort varighed af omrystning. De microglia udplades derefter ved høj renhed til eksperimentel undersøgelse.
Princippet og protokol af denne metode har væretbeskrevet i litteraturen 7,8. Derudover er alternative metoder til at isolere primære mikroglia velbeskrevet 9-12. Homogeniseret hjernevæv kan adskilles ved densitetsgradientcentrifugering til opnåelse primære microglia 12. Imidlertid centrifugering er af moderat længde (45 min) og kan forårsage cellulær skade og aktivering samt bevirke beriget microglia og andre cellepopulationer. En anden protokol er blevet anvendt til at isolere den primære microglia i en række organismer ved langvarig (16 timer) rystning, mens i kultur 9-11. Efter omrystning mediet supernatanten centrifugeret for at isolere microglia. Denne længere totrins-isolation Fremgangsmåden kan også forstyrre mikroglial funktion og-aktivering. Vi primært bruge følgende mikroglia isolation protokol i vores laboratorium for en række årsager: (1) primær mikroglia simulerer in vivo biologi mere trofast end udødeliggjorde gnaver mikroglia cellelinjer, (2) Nominel mekanisk sprængning minimerer potentialet cellulær dysfunktion eller aktivering, og (3) tilstrækkelig udbytte kan opnås uden passage af de blandede glial cellekulturer.
Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol bruger hjernevæv fra nyfødte rotteunger at isolere mikroglia og at brugen af ældre rotter til at isolere mikroglia kan i høj grad påvirke udbyttet, aktivering status og funktionelle egenskaber af isolerede mikroglia. Der er tegn på, at aldring er forbundet med mikroglia dysfunktion, øget neuroinflammation og neurodegenerative sygdomme, har det tidligere undersøgelser anvendes ex vivo voksen mikroglia til bedre at forstå betydningen af mikroglia i neurodegenerative sygdomme, hvor ældning er vigtig parameter. Imidlertid kan ex vivo microglia ikke holdes i kultur i længere perioder. Derfor, mens denne protokol forlænger levetiden af primær mikroglia i kultur, skal det bemærkes, at mikroglia opfører differently fra voksne mikroglia og de vitro undersøgelser bør overvejes nøje, når oversættes til en in vivo omgivelser.
Protocol
Discussion
Mens denne protokol rutinemæssigt anvendes til at producere ren og sund mikroglia for forskning eksperimenter, vil nøje overvejelse af de tekniske aspekter i kritiske dele af proceduren minimere variabilitet i den isolerede mikroglia. Første under dissektionen af hjernevæv fra neonatale rotteunger, der arbejder i tide er nødvendig for at minimere hypoxisk og iskæmisk skade på vævet. Det er imidlertid også vigtigt for fuldstændigt at fjerne meningeal belægningen fra hjernen under dissektion, fordi tilste…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieret af murene program på uniformerede Universitet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neurosciences. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
