El aislamiento de la microglía Primaria cultivos mixtos de células gliales del tejido neonatal cerebro de rata
Summary
Aislamiento de la microglía primaria a partir de la heterogeneidad celular del cerebro es esencial para investigar su papel en las dos condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo describe un aislamiento mecánico y técnica mixta de cultivo celular que proporciona un alto rendimiento y alta pureza, viables células primarias microgliales para<em> In vitro</em> Estudio y aplicaciones posteriores.
Abstract
La microglía representan aproximadamente el 12% de la población celular total en el cerebro de los mamíferos. Mientras que las neuronas y astrocitos son considerados como los principales tipos de células del sistema nervioso, la microglía desempeñar un papel importante en la fisiología normal del cerebro mediante el control de los tejidos de los escombros y los agentes patógenos y el mantenimiento de la homeostasis en el parénquima a través de la actividad fagocítica 1,2. Microglia se activan durante una serie de condiciones lesiones y enfermedades, incluyendo enfermedad neurodegenerativa, lesión cerebral traumática, y la infección del sistema nervioso 3. Bajo estas condiciones de activación, la microglía aumentar su actividad fagocítica, sufren cambios morpohological y proliferativa, y secretan activamente las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, quimiocinas pro-inflamatorias y citoquinas, que a menudo la activación de un circuito paracrina o autocrina 4-6. A medida que estas respuestas microgliales contribuir a la patogénesis de la enfermedad en enfermedades neurológicas, la investigación se centró en microglia está garantizado.
Debido a la heterogeneidad celular del cerebro, es técnicamente difícil obtener suficiente material muestra microglial con alta pureza durante los experimentos in vivo. La investigación actual sobre las funciones neuroprotectoras y neurotóxica de la microglía requieren un método de rutina técnica para generar constantemente microglia pura y saludable con el rendimiento suficiente para su estudio. Se presentan, en texto y video, un protocolo para aislar microglia primaria pura a partir de cultivos gliales mixtos para una variedad de aplicaciones posteriores. Brevemente, esta técnica utiliza tejido cerebral disociada de crías de rata neonatal para producir cultivos mixtos de células gliales. Después de que los cultivos gliales mixtas alcanzar la confluencia, microglía primarios son mecánicamente aislado del cultivo mediante un breve duración de agitación. La microglia se siembran con alta pureza para el estudio experimental.
El principio y el protocolo de esta metodología han sidodescrito en la literatura 7,8. Además, las metodologías alternativas para aislar microglia primarias están bien descritos 9-12. Tejido cerebral homogeneizada puede ser separado por centrifugación en gradiente de densidad para producir primaria microglía 12. Sin embargo, la centrifugación es de longitud moderada (45 min) y puede causar daño celular y la activación, así como, causar enriquecido microglía y otras poblaciones celulares. Otro protocolo se ha utilizado para aislar microglía primaria en una variedad de organismos por prolongada (16 h) agitando mientras que en la cultura 9-11. Después de agitar, el sobrenadante se centrifuga medios para aislar microglía. Este método de aislamiento ya dos pasos también pueden perturbar la función microglial y la activación. Se utilizan principalmente el siguiente protocolo microglía aislamiento en nuestro laboratorio para un número de razones: (1) primaria microglía simular en la biología in vivo más fielmente que líneas celulares inmortalizadas roedores microglia, (2) Mecánico interrupción nominal minimiza disfunción potencial celular o activación, y (3) el rendimiento se puede obtener suficiente sin paso de los cultivos de células gliales mixtas.
Es importante señalar que este protocolo utiliza el tejido cerebral de crías de rata neonatal para aislar microglia y que el uso de las ratas viejas para aislar microglía puede afectar significativamente el rendimiento, estado de activación, y las propiedades funcionales de aislado microglía. Hay evidencia de que el envejecimiento está relacionado con la disfunción microglia, neuroinflamación aumentado y patologías neurodegenerativas, estudios previos han utilizado para ex vivo para adultos microglia para comprender mejor el papel de la microglía en las enfermedades neurodegenerativas, donde el envejecimiento es un parámetro importante. Sin embargo, ex vivo microglía no se pueden mantener en cultivo durante períodos prolongados de tiempo. Por lo tanto, mientras que este protocolo se extiende la vida de la microglía primaria en cultivo, se debe señalar que la microglía comportan differently de los adultos microglia y en estudios in vitro deben ser cuidadosamente considerados cuando se traduce a un ajuste en vivo.
Protocol
Discussion
Si bien este protocolo se utiliza rutinariamente para producir la microglía pura y saludable para los experimentos de investigación, la consideración cuidadosa de los aspectos técnicos durante las partes críticas del procedimiento minimizar la variabilidad en la microglia aislado. En primer lugar, durante la disección del tejido cerebral de crías de ratas neonatales, trabajando en el momento oportuno es necesario para minimizar el daño hipóxico isquémica, y en el tejido. Sin embargo, también es importante eli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiado por el programa intramuros de la Universidad de Servicios Uniformados.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
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