Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu
Summary
Beynin hücresel heterojenite birincil mikroglia Yalıtımlı fizyolojik ve patolojik hem de kendi rolünü araştırmak için esastır. Bu protokol bir mekanik izolasyon ve yüksek verim ve yüksek saflıkta sağlar karışık hücre kültürü tekniği için geçerli birincil mikroglia hücreleri açıklar<em> In vitro</em> Çalışma ve aşağı uygulamaları.
Abstract
Memeli beyninde toplam hücresel nüfusunun yaklaşık% 12 için mikroglia hesabı. Nöronlar ve astrositler sinir sisteminin önemli hücre tipleri kabul edilirken, mikroglia enkaz ve patojenler için doku izlenmesi ve fagositik aktivite 1,2 ile parankiminde homeostazı koruyarak normal beyin fizyolojisi önemli bir rol oynamaktadır. Mikroglia nörodejeneratif hastalıklar, travmatik beyin hasarı ve sinir sistemi enfeksiyonu 3 de dahil olmak üzere yaralanma ve hastalık, bir dizi sırasında aktive edilir. Bu aktive edici koşullar altında, mikroglia, bunların fagositik aktiviteyi artırır morpohological ve proliferatif değişikliğe uğrar ve aktif reaktif oksijen ve nitrojen türlerinin, pro-inflamatuar kemokinler ve sitokinler salgılar, genellikle bir parakrin veya otokrin döngü 4-6 aktive. Bu mikroglial yanıtları nörolojik koşullarda hastalığı patogenezine katkıda gibi, araştırma m odaklandıicroglia garantilidir.
Beynin hücresel heterojenite nedeniyle, in vivo deneyler sırasında yüksek saflıkta yeterli mikroglial örnek materyal elde etmek teknik olarak zordur. Mikroglia nöroprotektif ve nörotoksik fonksiyonları üzerine Mevcut araştırma tutarlı çalışması için yeterli verimi ile saf ve sağlıklı mikroglia üretmek için rutin bir teknik yöntem gerektirir. Biz, metin ve video, aşağı çeşitli uygulamalar için karışık glia kültürlerden saf primer mikroglia izole etmek için bir protokol mevcut. Kısaca, bu tekniğin karışık glial hücre kültürü üretmek için yenidoğan sıçanların yavrularının ayrışmış beyin dokusu kullanır. Karışık glial kültürler konfluent ulaştıktan sonra, primer mikroglia mekanik çalkalama kısa bir süre ile kültür izole edilir. Mikroglia sonra deneysel çalışma için yüksek saflıkta kaplanıyor.
Bu yöntemin prensibi ve protokol olduLiteratürde 7,8 tarif. Buna ek olarak, birincil mikrogliya izole etmek için alternatif bir yöntem de 9-12 tarif edilmektedir. Homojenize beyin doku primer mikroglia 12 verim yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile ayrılabilir. Ancak, orta boy santrifüjleme (45 dakika) ve hücre hasar ve aktivasyonu, aynı zamanda, zenginleştirilmiş mikroglia ve diğer hücre popülasyonları neden neden olabilir. Başka bir protokol kültürünün çalkalama 9-11 iken (16 saat) uzamış organizmalar çeşitli primer mikroglia izole etmek için kullanılmıştır. Çalkalandıktan sonra, süpernatan ortam mikroglia izole etmek için santrifüje tabi tutulur. Bu işlem iki aşamalı bir yöntem ayrıca izolasyonu mikrogliyal fonksiyonu ve aktivasyon karıştırmayı olabilir. Biz esas nedenlerle bir dizi için laboratuvar aşağıdaki mikroglia izolasyon protokolü kullanır: (1) primer mikroglia (2, daha sadık ölümsüzleştirdi kemirgen mikroglia hücre hatları daha vivo biyoloji simüle) Nominal mekanik bozulma potansiyeli hücresel disfonksiyon veya aktivasyon en aza indirir, ve (3) yeterli verim karışık glial hücre kültürlerinin geçiş olmadan elde edilebilir.
Bu protokol mikroglia yalıtmak için yenidoğan sıçanların yavrularının beyin dokusu kullanır ve mikroglia önemli ölçüde izole mikroglia verimi, aktivasyon durumu ve fonksiyonel özelliklerini etkileyebilir izole etmek için büyük sıçan kullanarak bu dikkat etmek önemlidir. Yaşlanma mikroglia disfonksiyon, artmış nöro-inflamasyonu ve nörodejeneratif patolojileri ile bağlantılı olduğuna dair kanıtlar vardır, bu nedenle önceki çalışmalarda yaşlanmanın önemli bir parametre olduğu daha iyi nörodejeneratif hastalıklarda mikroglia rolünü anlamak için ex vivo yetişkin mikroglia kullandık. Bununla birlikte, ex vivo mikrogliya uzun süreler için kültür tutulması mümkün değildir. Bu protokolün bir kültürü primer mikroglianın ömrünü uzatır iken, bu nedenle, bu mikrogliya d davranırlar not edilmelidirin vivo ortamda bir tercüme ettiğimizde ifferently yetişkin mikroglia gelen ve in vitro çalışmalar dikkatle düşünülmelidir.
Protocol
Discussion
Bu protokol rutin araştırma deneyleri için saf ve sağlıklı mikroglia üretmek için kullanılır iken, prosedürün kritik parçalar sırasında teknik yönlerini dikkatle düşünülmesi izole mikroglia değişkenliği en aza indirecektir. İlk olarak, zamanında çalışan yenidoğan sıçanların yavrularının beyin dokusu, diseksiyon sırasında doku hipoksik ve iskemik hasarı en aza indirmek için gereklidir. Ancak, meninksler varlığı bu kültür şartlarında hızlı çoğalma hızı nedeniyle önemli f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Üniformalı Hizmetleri Üniversitesi intramural programı tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neurosciences. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
