工程和演变的合成腺相关病毒（AAV），基因治疗载体，通过DNA家族改组
Summary
我们展示了基本的技术，分子工程和发展合成腺相关病毒（AAV），基因治疗载体，通过DNA家族改组。此外，我们在文化或靶细胞在小鼠的增强属性的个体嵌合衣壳的选择和分析，并提供一般的指引，有代表性的例子。
Abstract
腺相关病毒（AAV），向量表示由于1有益特性的独特组合，一些用于治疗人类的基因转移的最有力的和有前途的车辆。包括底层野生型病毒和非常先进的方法生产高滴度，高纯度和临床级2重组载体的apathogenicity。另一项特别的优势超过其他病毒的腺相关病毒系统是一个自然发生的血清型，其中不同的基本属性，都可以很容易地设计载体，使用一个共同的协议1,2财富的可用性。此外，包括我们自己的团体最近已制定战略，利用这些天然病毒作为模板创建的合成相结合的多输入血清型的资产，或提高单个孤立的属性载体。各自的技术，以实现这些目标ARé任的DNA家族改组3， 即由他们根据部分同源性（通常> 80％，大多数腺相关病毒血清型），或肽显示4,5， 即通常7个氨基酸插入到重新组装各种AAV衣壳基因 的碎片理想肽介导的重新定位到所需的细胞类型的病毒衣壳的暴露循环。为了获得最大的成功，这两种方法都适用于高吞吐量的时尚据此协议缩放产生大约100万不同的衣壳变种库。每个克隆，然后组成一个独特的组合（DNA改组方法）众多家长病毒或病毒在同一骨干（肽显示方法）包含一个独特的肽。在随后的最后一步是迭代选择这样的靶细胞库，以丰富个人履行或理想的选择过程中的所有要求衣壳。后者最好梳INES积极的压力，如在某些细胞类型，利益与负选择，例如消除所有与抗AAV抗体反应衣壳增长。这种组合增加合成衣壳生存选择，在给定的应用程序可能会发现在任何自然发生的腺相关病毒分离的方式相匹配的需求的机会。在这里，我们专注于DNA家族改组方法的理论和实验两种技术的挑战。我们将介绍和演示洗牌腺相关病毒库的生成和选择（ 图1）所有必要的步骤，然后讨论存在的隐患和协议的重要方面，是一个需要知道为了成功与腺相关病毒的分子进化。
Protocol
1。制备质粒AAV衣壳基因编码集为了方便各种AAV衣壳基因 （ 帽 ），随后的DNA改组的足够数量的常规准备，初步亚克隆质粒骨干到一个共同的基因。包括后来作为引物结合的巢式PCR和克隆网站（ 图2）使用相同的侧翼> 20个核苷酸序列，这是非常重要的。 使用适当的引物（见AAV5模范引物表），从常见的腺相关病毒载体通常包含AAV2 rep基因的选择帽</e…
Discussion
在这里，我们提出必要的实验步骤和AAV衣壳工程的指导方针，通过DNA家族改组，并在细胞或动物的进化。从本质上讲，这些协议是标准化的程序，我们的腺相关病毒领域内首次报道于2008年3版本。虽然一阵别人的后续研究已经报道了许多修改，例如 ，10-13，我们目前的版本代表产生重复性的结果，而服从缩放和适应任何需要的基本策略。
尽管我们的努?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
感谢作者在海德堡大学卓越CellNetworks的集群Chica和海因茨·夏勒博士（CHS）的基础以及出色的支持，他们的实验室，团队成员和工作。我们对此表示赞赏腺相关病毒的分子进化，通过DNA家族改组已成为一个非常活跃的领域，我们三年前首次出版以来，因此不能引用在这里由于篇幅所限，其工作的有关出版物的所有作者道歉。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 |
| Restriction enzymes | NEB | Various |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202T |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes (NEB) | F-540S |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 |
| DMSO | Finnzymes (NEB) | F-540S (part of kit) |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) |
| Tris | Roth | 4855.2 |
| Ampicilin sodium salt | Roth | K029.2 |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-shield | 1114739 |
| Phenolred | Merck | 107241 |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L90K |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman-Coulter | 342414 |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect |
| Heating block | BIOER | MB-102 |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX81 |
| FACS analyser | Beckman-Coulter | Cytomics FC500 MLP |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 |
| Benzonase | Merck | 101695 |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene | 212207 |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC |
IDTDNA | Custom primer |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC |
IDTDNA | Custom primer |
References
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Citer Cet Article
Kienle, E., Senís, E., Börner, K., Niopek, D., Wiedtke, E., Grosse, S., Grimm, D. Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling. J. Vis. Exp. (62), e3819, doi:10.3791/3819 (2012).