Vi viser den grundlæggende teknik til molekylær konstruere og udvikle syntetiske Adeno-associerede virus (AAV) genterapivektorer via DNA familie blanding. Desuden leverer vi generelle retningslinjer og repræsentative eksempler på udvælgelse og analyse af individuelle kimære capsider med forbedrede egenskaber på målceller i kultur eller i mus.
Adeno-associerede virale (AAV) vektorer repræsenterer nogle af de mest potente og lovende køretøjer til terapeutisk human genoverførsel grund af en unik kombination af fordelagtige egenskaber 1. Disse omfatter apathogenicity de underliggende vildtype vira og de avancerede metoder til fremstilling af høj-titer, høj renhed og klinisk kvalitet rekombinante vektorer 2. En yderligere særlig fordel ved den AAV-systemet i forhold til andre vira er tilgængeligheden af et væld af naturligt forekommende serotyper, som afviger i væsentlige egenskaber endnu kan alle let konstrueres som vektorer under anvendelse af en almindelig protokol 1,2. Desuden har en række grupper, herunder vores egen nylig udtænkt strategier til at bruge disse naturlige virus som skabeloner til oprettelse af syntetiske vektorer, som enten kombinerer aktiver af flere input serotyper, eller der forbedrer egenskaberne ved et enkelt isolat. De respektive teknologier til at opnå disse mål are enten DNA familien blander 3, dvs fragmentering af forskellige AAV capsid gener efterfulgt af deres re-samling er baseret på partielle homologieme (typisk> 80% for de fleste AAV-serotyper), eller peptid display 4,5, dvs indsættelse af normalt syv aminosyrer i en eksponeret sløjfe af det virale capsid, hvor peptidet ideelt medierer re-målretning til en ønsket celletype. For at opnå maksimal succes, er begge metoder anvendes på en high-throughput fashion, hvor protokollerne er op-skaleret til at give biblioteker på omkring en million forskellige capsid varianter. Hver klon derpå omfatter en unik kombination af talrige parentale virus (DNA shuffling metode) eller indeholder en karakteristisk peptid i den samme virale rygraden (peptid display fremgangsmåde). Den efterfølgende sidste trin er iterativ udvælgelse af et sådant bibliotek på målceller for at berige for de enkelte capsider, der opfylder de fleste eller ideelt alle krav udvælgelsesprocessen. Sidstnævnte fortrinsvis kamines positivt tryk, såsom vækst på en bestemt celletype af interesse, med negativ selektion for eksempel fjernelse af alle capsider reagerer med anti-AAV-antistoffer. Denne kombination øger chancerne for, at syntetiske capsiderne overlevende valget matcher behovene i given applikation på en måde, der sandsynligvis ikke ville have fundet i noget naturligt forekommende AAV isolere. Her fokuserer vi på DNA-familien blander metode som teoretisk og eksperimentelt mere udfordrende af de to teknologier. Vi beskriver og demonstrere alle væsentlige skridt til generering og udvælgelse af blandet AAV biblioteker (fig. 1), og derefter drøfte de faldgruber og kritiske aspekter af protokollerne, at man skal være opmærksom på for at lykkes med molekylær AAV evolution.
Her har vi skitseret væsentlige eksperimentelle trin og retningslinjer for AAV kapsid engineering via DNA-familien blander og for evolution i celler eller dyr. I det væsentlige er disse protokoller standardiserede versioner af de procedurer, vi først rapporteret i AAV feltet i 2008 3. Mens en byge af opfølgende undersøgelser af andre har rapporteret talrige ændringer fx 10-13, vores nuværende versioner repræsenterer grundlæggende strategier der giver reproducerbare resultater og s…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker for fremragende støtte for deres laboratorium, teammedlemmer og arbejde med Cluster of Excellence CellNetworks på Heidelberg Universitet, samt ved Chica og Heinz Schaller (CHS) fundament. Vi sætter pris på, at molekylær AAV evolution via DNA-familien blander er blevet et meget aktivt område siden vores første udgivelse for tre år siden, og derfor undskylder over for alle forfattere af relevante publikationer, hvis arbejde kan ikke blive citeret her på grund af pladsmangel.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
DNase I | Invitrogen | 18068-015 |
Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 |
Restriction enzymes | NEB | Various |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202T |
Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
Phusion II polymerase Kit | Finnzymes (NEB) | F-540S |
HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 |
DMSO | Finnzymes (NEB) | F-540S (part of kit) |
EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) |
Tris | Roth | 4855.2 |
Ampicilin sodium salt | Roth | K029.2 |
dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 |
Iodixanol (OptiPrep) | Axis-shield | 1114739 |
Phenolred | Merck | 107241 |
Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 |
Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L90K |
Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman-Coulter | 342414 |
Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell |
Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect |
Heating block | BIOER | MB-102 |
Fluorescence microscope | Olympus | IX81 |
FACS analyser | Beckman-Coulter | Cytomics FC500 MLP |
MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 |
Benzonase | Merck | 101695 |
Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 |
pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene | 212207 |
cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC |
IDTDNA | Custom primer |
cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC |
IDTDNA | Custom primer |