Engineering en Evolutie van synthetische adeno-geassocieerd virus (AAV) gentherapievectoren via DNA Family Shuffling
Summary
We tonen de basistechniek om moleculair ingenieur en synthetische adeno-geassocieerde virale (AAV) gentherapievectoren evolueren via DNA-familie shuffelen. Bovendien geven we algemene richtlijnen en representatieve voorbeelden voor de selectie en analyse van individuele chimere capsiden met verbeterde eigenschappen op doel cellen in cultuur of in muizen.
Abstract
Adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren zijn enkele van de meest krachtige en veelbelovende voertuigen voor therapeutische menselijke gen-overdracht als gevolg van een unieke combinatie van gunstige eigenschappen: 1. Deze omvatten de apathogenicity van de onderliggende wild-type virussen en de zeer geavanceerde methoden voor de productie van high-titer, hoge zuiverheid en klinisch-grade recombinante vectoren 2. Een ander bijzonder voordeel van de AAV-systeem ten opzichte van andere virussen is de beschikbaarheid van een schat van natuurlijk voorkomende serotypen die verschillen in essentiële eigenschappen nog kunnen allemaal gemakkelijk worden gemanipuleerd als vectoren met behulp van een gemeenschappelijk protocol 1,2. Bovendien hebben een aantal groepen met inbegrip van onze eigen onlangs bedacht strategieën om deze natuurlijke virussen gebruiken als sjablonen voor het maken van synthetische vectoren die ofwel een combinatie van de activa van multiple input serotypen, of die verbetering van de eigenschappen van een enkele isoleren. De respectieve technologieën om deze doelen te bereiken are ofwel DNA-familie schudden 3, dat wil zeggen de versnippering van de verschillende AAV capside genen gevolgd door hun re-assemblage gebaseerd op gedeeltelijke homologieën (meestal> 80% voor de meeste AAV serotypes), of peptide-display 4,5, dat wil zeggen het inbrengen van meestal zeven aminozuren in een blootgestelde lus van het virale capside waarbij het peptide voorkeur medieert opnieuw richten een gewenste celtype. Voor een maximaal resultaat zijn beide methoden toegepast in een hoge-doorvoer wijze waarbij de protocollen opgeschaald bibliotheken van ongeveer een miljoen verschillende capside varianten opleveren. Elke kloon wordt dan uit een unieke combinatie van vele virussen ouderlijke (DNA-shuffelen benadering) of bevat een karakteristieke peptide in dezelfde virale ruggengraat (peptide elkaar benadering). De daaropvolgende laatste stap is iteratief selectie van een dergelijke bibliotheek op doelcellen om te verrijken voor individuele capsiden vervullen van de meeste of idealiter aan alle eisen van het selectieproces. De laatste bij voorkeur kamines overdruk, zoals groei op een bepaald celtype van belang met negatieve selectie bijvoorbeeld verwijdering van alle capsiden reageren met anti-AAV antilichamen. Deze combinatie verhoogt de kans dat de synthetische capsiden het overleven van de selectie van de behoeften van de specifieke toepassing op een manier die waarschijnlijk niet zou zijn in een van nature voorkomende AAV isoleren evenaren. Hier richten we ons op de DNA-familie shuffelwerkwijze als het theoretisch en experimenteel grotere uitdaging van de twee technologieën. We beschrijven en demonstreren van alle essentiële stappen voor het genereren en selectie van geschud AAV bibliotheken (afb. 1), en dan bespreken de valkuilen en kritische aspecten van de protocollen die men moet zich bewust zijn van om te slagen met moleculaire AAV evolutie.
Protocol
Discussion
Hier hebben we geschetst van essentieel belang experimentele stappen en richtlijnen voor de AAV capside techniek via DNA-shuffelen en familie voor de evolutie in cellen of bij dieren. In essentie zijn deze protocollen zijn gestandaardiseerd versies van de procedures die we voor het eerst binnen de AAV gebied gemeld in 2008 3. Terwijl een vlaag van follow-up studies van anderen hebben gemeld talrijke wijzigingen bv, 10-13, onze huidige versies zijn basisstrategieën opleveren reproduceerbar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zeer erkentelijk voor uitstekende ondersteuning van hun lab, teamleden en werk van de Cluster of Excellence CellNetworks aan de Universiteit van Heidelberg en door de Chica en Heinz Schaller (CHS) stichting. We waarderen het dat de moleculaire AAV evolutie via DNA-familie shuffling is uitgegroeid tot een zeer actieve gebied sinds onze eerste publicatie drie jaar geleden en daarom excuses aan alle auteurs van relevante publicaties van wie het werk kon hier niet geciteerd worden als gevolg van ruimtegebrek.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 |
| Restriction enzymes | NEB | Various |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202T |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes (NEB) | F-540S |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 |
| DMSO | Finnzymes (NEB) | F-540S (part of kit) |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) |
| Tris | Roth | 4855.2 |
| Ampicilin sodium salt | Roth | K029.2 |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-shield | 1114739 |
| Phenolred | Merck | 107241 |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L90K |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman-Coulter | 342414 |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect |
| Heating block | BIOER | MB-102 |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX81 |
| FACS analyser | Beckman-Coulter | Cytomics FC500 MLP |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 |
| Benzonase | Merck | 101695 |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene | 212207 |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC |
IDTDNA | Custom primer |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC |
IDTDNA | Custom primer |
References
- Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
- Grimm, D. Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes. Methods. 28, 146-157 (2002).
- Grimm, D. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).
- Muller, O. J. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).
- Perabo, L. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).
- Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. A “humanized” green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).
- Wobus, C. E. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).
- Grimm, D. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature. 441, 537-541 (2006).
- Nakai, H. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice. J. Virol. 79, 214-224 (2005).
- Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).
- Li, W. Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).
- Ward, P., Walsh, C. E. Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction. Virology. 386, 237-248 (2009).
- Yang, L. A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).
- Perabo, L. Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).
- Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors. Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).
- Kwon, I., Schaffer, D. V. Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).
- Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. Artificial evolution with adeno-associated viral libraries. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).
- McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).
