シャッフルDNAファミリーを経由して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療ベクターのエンジニアリングと進化
Summary
我々は分子DNAファミリーシャフリングを介して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）の遺伝子治療ベクターを設計し、進化するための基本的なテクニックを示しています。さらに、一般的なガイドラインや文化やマウスの標的細胞上の強化されたプロパティを持つ個々のキメラキャプシドの選択と分析のための代表的な例を提供しています。
Abstract
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、有益な特性の1のユニークな組み合わせにより、治療用ヒト遺伝子導入のための最も強力かつ有望な車両の一部を表しています。これらは、基礎となる野生型ウイルスと高力価、高純度、臨床グレードの組換えベクター2の生産のための高度な方法論のapathogenicityが含まれています。他のウイルス以上のAAVシステムの更なる特定の利点は、当然、まだすべて簡単に一般的なプロトコルの1,2を使用してベクトルとして操作することができる本質的な特性で異なる血清型に発生するの富の可用性です。また、私たち自身を含むグループの数は、最近、どちらか、複数の入力の血清型の資産、またはその分離、単一の特性を向上させるを組み合わせて合成ベクトルを作成するためのテンプレートとして、これらの天然のウイルスを使用するための戦略を考案した。これらの目標ARを実現するためにそれぞれの技術電子どちらDNA家族シャフ3、部分的相同性に基づいて再組み立てに続いて様々なAAVキャプシド遺伝子のつまり断片化（通常はほとんどのAAV血清型のために> 80％）、またはペプチドディスプレイには通常7つのアミノ酸の4,5、 すなわち挿入ペプチドは、理想的に所望の細胞型への再ターゲティングを媒介ウイルスキャプシドの露出したループ。最大の成功のために、両方の方法は、約100万の異なるカプシド変異体のライブラリを生成するためにプロトコルがアップスケーリングされることにより、高スループットな方法で適用されます。各クローンは、その後多数の親ウイルスのユニークな組み合わせ（DNAシャフリングアプローチ）から構成されるか、同じウイルスのバックボーン（ペプチドディスプレイアプローチ）内の独特のペプチドが含まれています。その後の最後のステップでは、ほとんど、または選択プロセスの理想的なすべての要件を満たす個々のカプシドを濃縮するために、標的細胞上のそのようなライブラリの選択を繰り返します。後者は、好ましくは、櫛抗AAV抗体と反応するすべてのキャプシドのインスタンスを除去するための負の選択とそのような興味のある特定の細胞型の成長としてINES正圧、、、。この組み合わせは選択を生き残った合成キャプシドは、おそらく任意の天然AAV分離で発見されなかったであろう方法で、特定のアプリケーションのニーズと一致している可能性が高くなります。ここでは、DNAのファミリー2つの技術の理論と実験のより困難なようにメソッドをシャッフルに焦点を当てています。我々は、記述し、実証するシャッフルAAVライブラリの生成と選択（ 図1）の重要なすべての手順を実行し、次に1つのニーズは、分子AAVの進化を成功させるために注意すべきことのプロトコルの落とし穴や重要な側面について説明します。
Protocol
Discussion
ここでは、DNAシャフリングを介して家族や細胞や動物の進化に不可欠な実験の手順およびAAVキャプシドエンジニアリングのためのガイドラインを概説しています。本質的には、これらのプロトコルは、2008年3我々は最初のAAVのフィールド内で報告手順の標準化バージョンです。他の人の研究のフォローアップの突風は、多くの変更、 例えば 、10から13を報告し?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者は感謝してハイデルベルク大学で優秀CellNetworksのクラスタで同様にチカとハインツシャラー（CHS）の基礎によって彼らのラボは、チームメンバーとの仕事の優れたサポートを認める。我々はDNAファミリーシャフリングを介して分子のAAVの進化は、三年前に我々の最初の出版以来、非常にアクティブなフィールドになるので、仕事に関連する出版物のすべての著者に謝罪しました感謝は、スペースの制約からここでは引用できませんでした。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 |
| Restriction enzymes | NEB | Various |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202T |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes (NEB) | F-540S |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 |
| DMSO | Finnzymes (NEB) | F-540S (part of kit) |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) |
| Tris | Roth | 4855.2 |
| Ampicilin sodium salt | Roth | K029.2 |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-shield | 1114739 |
| Phenolred | Merck | 107241 |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L90K |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman-Coulter | 342414 |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect |
| Heating block | BIOER | MB-102 |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX81 |
| FACS analyser | Beckman-Coulter | Cytomics FC500 MLP |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 |
| Benzonase | Merck | 101695 |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene | 212207 |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC |
IDTDNA | Custom primer |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC |
IDTDNA | Custom primer |
References
- Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
- Grimm, D. Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes. Methods. 28, 146-157 (2002).
- Grimm, D. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).
- Muller, O. J. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).
- Perabo, L. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).
- Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. A “humanized” green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).
- Wobus, C. E. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).
- Grimm, D. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature. 441, 537-541 (2006).
- Nakai, H. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice. J. Virol. 79, 214-224 (2005).
- Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).
- Li, W. Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).
- Ward, P., Walsh, C. E. Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction. Virology. 386, 237-248 (2009).
- Yang, L. A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).
- Perabo, L. Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).
- Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors. Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).
- Kwon, I., Schaffer, D. V. Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).
- Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. Artificial evolution with adeno-associated viral libraries. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).
- McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).
