Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes
Summary
Mycobacterium tuberculosis forma biofilmes de drogas tolerantes quando cultivadas em certas condições. Aqui descrevemos métodos para cultura de M. biofilmes de tuberculose e que determinam a freqüência de persistentes drogas tolerantes. Estes protocolos serão úteis para estudos posteriores sobre os mecanismos de tolerância à droga em M. tuberculose.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, agente etiológico da tuberculose humana, tem uma capacidade extraordinária para sobreviver contra estresses ambientais, incluindo antibióticos. Embora a tolerância ao estresse de M. tuberculose é um dos provavelmente contribui para a quimioterapia 6-mês longo da tuberculose 1, os mecanismos moleculares subjacentes ao fenótipo característica do agente patogénico permanecem incertos. Muitas espécies microbianas evoluíram para sobreviver em ambientes estressantes por auto-montagem em superfície altamente organizada, em anexo, e estruturas matriciais encapsulados chamados biofilmes 2-4. Crescimento em comunidades parece ser uma estratégia de sobrevivência preferida de micróbios, e é conseguida por meio de componentes genéticos que regulam fixação superfície, as comunicações intercelulares, e síntese de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) 5,6. A tolerância ao estresse ambiental é provavelmente facilitada pela EPS, e talvez pelo fisiolóadaptação tecnológico de bacilos indivíduo a microambientes heterogêneos dentro da complexa arquitetura de biofilmes 7.
Em uma série de trabalhos recentes, estabeleceu que M. tuberculosis e Mycobacterium smegmatis têm uma forte propensão para crescer em organizados estruturas multicelulares, chamado biofilmes, que pode tolerar mais de 50 vezes as concentrações inibitórias mínimas das drogas anti-tuberculose isoniazida e rifampicina 8-10. M. tuberculose, no entanto, intrigantemente requer condições específicas para formar biofilmes maduros, em proporção de 9:1 particular de headspace: meios bem como a troca limitada de ar com a atmosfera 9. Requisitos de especializados condições ambientais poderia possivelmente ser ligada ao facto de que a M. tuberculosis é um patógeno humano obrigatório e, portanto, se adaptou aos ambientes de tecido. Nesta publicação, demonstrar os métodos para cultura de M. tuberculosebiofilme em uma garrafa e um formato de placa de 12 poços, que é conveniente para estudos bacteriológicos, bem como genéticos. Nós descrevemos o protocolo para uma estirpe atenuada de M. tuberculose, mc dois 7000, com supressão nos dois loci, panCD e RD1, que são críticas para crescimento de vivo do agente patogénico 9. Esta variedade pode ser usado com segurança em uma contenção BSL-2 para a compreensão da biologia básica do patógeno tuberculose, evitando assim a exigência de uma instalação de BSL-3 caro. O método pode ser estendida, com modificação adequada em meios de comunicação, a crescer biofilme de outras espécies de micobactérias cultiváveis.
Em geral, um protocolo uniforme de biofilmes cultura de micobactérias vai ajudar os pesquisadores interessados em estudar as características básicas resistentes de micobactérias. Além disso, um método claro e conciso do crescimento de biofilmes de micobactérias também irá ajudar o inv clínica e farmacêuticaestigators para testar a eficácia de um fármaco potencial.
Protocol
Discussion
A tuberculose (TB), causada pela infecção do Mycobacterium tuberculosis, continua a ser uma grande ameaça à saúde pública global. Quase um terço da população mundial é estimada para ser assintomática infectada pelo patógeno, cerca de 9 milhões de novos casos aparecem na clínica todos os anos com sintomas de tuberculose ativa e cerca de 1,7 milhões morrem da infecção a cada ano 11. O enorme fardo da doença é essencialmente contribuído por falta de uma vacina e uma quimioterapia mui…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi realizado com apoio financeiro do Instituto Nacional de Saúde e American Lung Association.
Materials
| Equipment and supplies | SUPPLIER | CATALOG NUMBER |
| Incubator | VWR | Model # 1923/25 |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 |
| 12-well tissue culture plate | VWR | 62406-165 |
| 50-mL conical tubes | VWR | 89039-660 |
| Rocker | Thermo Scientific | 57019-662 |
| Chromatographic refrigerator | VWR | 55702-520 |
| petri dish | VWR | 25384-342 |
| REAGENT | SUPPLIER | CATALOG NUMBER |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD | PX1565-1 |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 |
| L-asparagine | Sigma | A4284-100G |
| citric acid | Sigma | C1857-100G |
| ferric ammonium citrate | Sigma | F5879-100G |
| glycerol | EMD | GX0185-5 |
| NaOH | Sigma | S8045-500G |
| ZnSO4 | Sigma | Z4750-500G |
| D-pantothenic acid | Sigma | P2250-25G |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | Becton Dickinson | 271310 |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 |
| Tween-80 | Fisher | T164-500 |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 |
| 12 well plates | Falcon (BD) | 353043 |
| rifampicin | Sigma | R3501-1G |
| methanol | J.T. Baker | 9070-05 |
| 10mlLsyringe | Becton Dickinson | 301604 |
| 1-200μL pipet tips | VWR | 89079-458 |
| parafilm M | VWR | PM-996 |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | Becton Dickinson | 283810 |
| NaCl | Fisher | BP358-1 |
| KCl | Sigma | P9333-500G |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma | S0876-500G |
References
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