Un système de neurones primaires de la culture pour l'étude de l'herpès simplex virus de latence et de réactivation

Summary

Le protocole décrit un système de modèle efficace et reproductible pour étudier l'herpès simplex virus type 1 (HSV-1) temps de latence et la réactivation. Le dosage utilise des cultures de neurones sympathiques homogènes et permet pour la dissection moléculaire des virus de neurones interactions en utilisant une variété d'outils, y compris l'interférence ARN et d'expression de protéines recombinantes.

Abstract

Herpes simplex virus de type 1 (HSV-1) établit une infection latente long de la vie dans les neurones périphériques. Ce réservoir latent est la source d'événements récurrents qui réactivation d'assurer la transmission et de contribuer à la maladie clinique. Antiviraux actuels n'ont aucune incidence sur le réservoir latent et il n'existe aucun vaccin. Bien que les détails moléculaires de la réplication lytique sont bien caractérisés, les mécanismes de contrôle de latence dans les neurones restent insaisissables. Notre compréhension actuelle de la latence est dérivé d'études in vivo utilisant des modèles de petits animaux, qui ont été indispensables pour définir les exigences de gènes viraux et le rôle des réponses immunitaires. Cependant, il est impossible de distinguer les effets spécifiques sur la relation virus-neurone à partir des conséquences plus générales de l'infection médiée par les cellules immunitaires de soutien ou de non-neuronale dans les animaux vivants. En outre, l'expérimentation animale est coûteux, chronophage, et limitée en termes d'options disponibles pour la manipulation de l'hôteprocessus. Pour surmonter ces limitations, un système de neurones seule est désespérément nécessaire qui reproduit les caractéristiques de l'in vivo de la latence et la réactivation, mais offre les avantages de la culture de tissus en termes d'homogénéité et de l'accessibilité.

Nous présentons ici les plus un modèle in vitro utilisant cultivées primaires neurones sympathiques de rat ganglions cervicaux supérieurs (SCG) (Figure 1) pour étudier le HSV-1 de latence et la réactivation qui correspond si ce n'est pas tous les critères souhaités. Après avoir éliminé les cellules non neuronales, près homogènes TrkA ^{+ de} cultures de neurones sont infectés par le HSV-1 en présence d'acyclovir (ACV) pour supprimer la réplication lytique. Après l'enlèvement ACV, non-productives HSV-1 infections qui présentent fidèlement caractéristiques reconnues de latence sont efficacement mis en place. Notamment, les ARNm lytiques, les protéines et de virus infectieux devenir indétectable, même en l'absence de sélection, mais la latence associée à la transcription (LAT) exprimentions persiste dans les noyaux des neurones. Les génomes viraux sont maintenus à un nombre de copies en moyenne de 25 par neurone et peut être amené à répliquer de manière productive en interférant avec la PI3-kinase / AKT signalisation ou le retrait pur et simple du facteur de croissance nerveuse ^1. Un EGFP recombinante HSV-1 fusionnée à la codage virale protéine lytique Us11 fournit une fonction, en temps réel marqueur pour la réplication résultant de réactivation qui est facilement quantifié. En plus de traitements chimiques, les méthodes génétiques telles que la livraison interférence ARN ou d'un gène par des vecteurs lentiviraux peut être appliquée avec succès au système permettant d'études mécanistes qui sont très difficiles, voire impossible, chez les animaux. En résumé, la CTB à base de HSV-1 de latence / réactivation du système fournit un outil puissant, nécessaire pour élucider les mécanismes moléculaires contrôlant la latence et la réactivation de HSV1 dans les neurones, un puzzle de longue date en virologie dont la solution peut offrir des perspectives nouvelles dans le développement de nouvelles thérapies qui t cibleil latente réservoir herpèsvirus.

Protocol

1. Isolement et culture des neurones d'embryons de rat CTB

Pour fournir un contexte utile pour la compréhension de ce protocole, et pour une discussion approfondie de la littérature plus tôt que les méthodes établies de CTB neurone culture, y compris la base de la CTB en culture in vitro, la plaque de revêtement des substrats, et les composants de milieux exempts de sérum, la lecteur est renvoyé aux références ^2-4.

1. L'utilisation de rats en tant que source pour les neurones SCG a été menée conformément aux lignes directrices des NIH en vertu d'un protocole actif approuvé par le soin des animaux institutio....

Discussion

Cette culture de neurones primaires et du système d'infection fournit une méthode simple et efficace pour explorer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le HSV-1 de latence et la réactivation. Le système fidèlement récapitule les poinçons acceptées de latence définies dans les deux infections humaines et d'animaux vivants des modèles. Lorsque le virus est latent dans les cultures CTB, des particules virales infectieuses et des produits géniques lytiques ne peut pas être détecté. Le produi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactif	Entreprise	Catalogue #	Commentaires
70μm filtre en nylon (tamis cellulaire)	BD Biosciences	352350
1x Hank Balanced Salt Solution (HBSS - / -)	Invitrogen	14175	w / o CaCl 2 et MgCl 2
1x minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11095-080
Le 5-fluoro-2'-désoxyuridine	Sigma	F0503	préparer 20 mm Stock en 1x MEM; conserver à -20 ° C
96-bien à plat des plaques de fond de puits de TC	Corning	3599
Acyclovir	Calbiochem	114798	préparer 31 Stock mM dans le DMSO; conserver à -20 ° C
Aphidicoline	Calbiochem	178273	préparer 10 mM dans le DMSO de stock; conserver à -20 ° C
B-27 Supplément	Invitrogen	17504-44
Collagenase	Sigma	C2674	préparer 10 mg / ml de bouillon de HBSS en - / -; conserver à -20 ° C
D-(+)-glucose	Sigma	G6152	prépare un bouillon de 40% en H 2 O; filtre stériliser et stocker à 4 ° C
L-glutamine	Invitrogen	25030-081
La laminine	Sigma	L2020	préparer 1 mg / ml de bouillon de H 2 O dans; de congélation rapide 20 pialiquats et conserver à -80 ° C; diluée à 2 ug / ml conc travail. dans stérile H 2 O
Leibovit'z L-15 médias	Invitrogen	11415
Nerve Growth Factor	Harlan Laboratories	BT.5017	préparer 50 pg / ml de bouillon de HBSS en - / -; magasin à -80 ° C
Milieu Neurobasal	Invitrogen	12348
Phosphonoacétique acide (AAP)	Sigma	P6909	préparer 75 mg / ml de bouillon de dans H 2 O; conserver à -20 ° C
Poly-D-lysine bromhydrate	Sigma	P0899	préparer 20 mg / ml de bouillon de dans H 2 O; conserver à -20 ° C
Rat-collagène de queue	Millipore	08-115	Concentration varie avec beaucoup d'approvisionnement; conserver à 4 ° C et dilué à 0,66 mg / ml concentré de travail. dans stérile H 2 O
Un trichostatine	Sigma	T8552	préparer 1 mM dans le DMSO de stock; conserver à -20 ° C
Trypsine 2,5%	Invitrogen	15090-04