I denne artikel, udviser vi analyser for at studere termisk nociception i<em> Drosophila</em> Larver. En analyse involverer rumligt begrænset (lokale) stimulering af termiske nociceptorer<sup> 1,2</sup> Mens den anden omfatter en gros (global) aktivering af de fleste eller alle disse neuroner<sup> 3</sup>. Sammen disse teknikker tillader visualisering og kvantificering af de adfærdsmæssige funktioner<em> Drosophila</em> Nociceptive sensoriske neuroner.
I denne artikel, udviser vi analyser for at studere termisk nociception i Drosophila larver. En analyse involverer rumligt begrænset (lokale) stimulering af termisk nociceptorer 1,2, mens den anden involverer en gros (global) aktivering af de fleste eller alle disse neuroner 3. Sammen disse teknikker tillader visualisering og kvantificering af de adfærdsmæssige funktioner Drosophila nociceptive sensoriske neuroner.
Drosophila larver er en etableret modelsystem til undersøgelse termisk nociception, en sensorisk reaktion potentielt skadelige temperaturer, der er evolutionært konserverede på tværs af arter 1,2. Fordelene ved Drosophila for sådanne undersøgelser er den relative enkelhed af nervesystemet og sofistikerede de genetiske teknikker, der kan anvendes til at dissekere den molekylære basis for den underliggende biologiske 4-6 Drosophila, som i alle metazoans de response til skadelige termiske stimuli generelt indebærer et "nocifensive" aversiv tilbagetrækning til den præsenterede stimulus 7. Sådanne stimuli detekteres ved frie nerveender eller nociceptorer og amplituden af organismal respons afhænger af antallet af nociceptorer modtager skadelig stimulus 8. I Drosophila, er det klasse IV dendritiske arborization sensoriske neuroner, der registrerer skadelige termiske og mekaniske stimuli 9 i tillæg til deres nyligt opdaget rolle som fotoreceptorer 10. Disse neuroner, der er blevet rigtig godt studeret på det udviklingsmæssige niveau, arborize over barrieren epidermisarket og skabe kontakt med næsten alle epidermale celler 11,12. Den enkelte axon af hver klasse IV neuron projekter i den ventrale nerve ledningen af det centrale nervesystem 11, hvor de kan forbinde til anden ordens neuroner dette projekt til hjernen.
Under baseline forhold, nociceptive sensorisk neurons vil ikke fyre, indtil en relativt høj tærskel er nået. Analyserne beskrevet her tillader investigator at kvantificere baseline adfærdsmæssige reaktioner eller, formentlig, den overfølsomhed, som indledes efter vævsskade. Hver analyse provokerer forskellige, men beslægtede bevægelsesmæssigt adfærdsmæssige reaktioner på skadelige termiske stimuli og tillader forskeren at visualisere og kvantificere forskellige aspekter af termisk nociception i Drosophila larver. De assays kan anvendes til larver af ønskede genotyper eller larver hævet under forskellige miljøforhold, der kan påvirke nociception. Da termisk nociception er bevaret på tværs af arter, vil resultaterne hentet fra genetisk dissektion i Drosophila sandsynligt informere vores forståelse af termisk nociception i andre arter, herunder hvirveldyr.
De assays der er beskrevet her, kan anvendes til kvalitativt og kvantitativt at vurdere larver af forskellige genotyper for modtagelighed for skadelige termiske stimuli. Et væsentligt element i den varme sonden analysen er, at stimulus gives kun på et enkelt locus. Dette sandsynligvis fører til brænding af kun en lille delmængde af klasse IV neuroner-de dem i segment i kontakt med proben og måske dem, umiddelbart tilstødende segmenter 11. På grund af lokal stimulering efterligner den varme proben assayet fælles sanseoplevelse for at detektere en skadelig stimulus, der er lokaliseret til et særligt organ region, såsom en hånd at kontakte en varm ovn. En ulempe ved den varme proben assayet er, at det har en bruger til bruger variabilitet, som kan sandsynligvis tilskrives tre faktorer: i) det tryk, hvormed brugeren anvender probe til larve, ii) den nøjagtige placering af proben på larve i forhold til de underliggende nociceptive neuroner, og iii) nøjagtige angle, hvor proben er i kontakt med overfladen af larver.
Vi har tidligere rapporteret en kvantitativ strategi kategorisere larver i non-responders, langsomme respondenter og hurtige respondenter baseret på deres tilbagetrækning ventetid til en given temperatur 1. Her har vi rapportere om larver lydhørhed over for endnu højere temperaturer. Interessant, finder vi, at der er et loft for larver termiske nociceptive responser, og at dette loft ligger mellem 52 og 54 ° C. Dette kan indikere, larver ikke besidder en transient receptor potentiale (TRP) kanal er i stand til gating ved temperaturer højere end 52 ° C. Alternativt kunne det tyder på, at de neuroner eller muskler, der anvendes til at indlede eller udføre motorisk reaktion bliver beskadiget, før de overhovedet kan fungere i aversiv tilbagetrækning. Vi rapporterer en anden analyse af amplituden af nedtrapningsrespons der anvender enten antallet af ruller som en indikator for den "robusthed" af reaktionen. Naivt, enville forvente, at disse parametre vil stige med stigende temperatur eller tid stimulering. Overraskende finder vi, at dette ikke er tilfældet. Larver stimuleret i længere tid ved en temperatur i den lave ende af skadelige område (42 ° C) viser flere ruller og mere tid rullende end larver probet ved højere temperaturer (48-52 ° C). Dette antyder, at i det skadelige temperaturen vinduet er det primært varigheden af eksponeringen, som bestemmer amplituden af responset. Idet larver udsættes for meget skadelige temperaturer (48-52 ° C) reagerer gennemsnit meget hurtigt, udviser de ikke så mange valser som larver udsættes for en mindre skadelig temperatur i et længere tidsrum. Analysen af responsamplituden rapporteret her tilføjer en anden kvantitativ dimension langs hvilken forskellige genotyper eller miljømæssige manipulationer kan sammenlignes.
Et væsentligt element i den varme plade analysen er, at det indebærer en global eksponering for skadeligevarme. Som sådan er det mere beslægtet med dyret sidder i en opvarmet kedel end røre en varm ovn. Selv om det ikke er klart, når en larve kan opleve en globalt skadelig stimulus i naturen, i laboratoriet de adfærdsmæssige reaktioner på denne globale eksponering er mere komplekse end dem observeret ved lokal stimulering. En styrke af varme pladeassayet, bemærkede også af andre 3, er, at den har ringe bruger-til-bruger variabilitet siden berøre larve ikke er en del af protokollen. Den eneste væsentlige afvigelse synes at være at definere, når hver adfærd begynder, og dette kan minimeres med gentaget visning / fortrolighed. En interessant forskel mellem assays er de temperaturer, ved hvilke afskrækningsmidler adfærd påbegyndes. Disse er meget lavere i den varme plade assayet end den varme proben. Den indledende adfærd, der udvises af larver i kontakt med den varme probe (hoved og hale raise) kan være en korrelere af hovedet thrash observeret ved ~ 27 ° C i den varme plate assay. Det er muligt, at dette svar afspejler "ubehag" mere end "smerte". Vi har ikke observeret et modstykke til piskning, beslaglæggelse, og paralyse selv ved høj (op til 48 ° C) temperaturer i varmen sonden analysen og det kan være, at en kritisk masse af sensorisk neuron skyde fra mere end én region af kroppen er nødvendigt for at bringe disse adfærdsmønstre. Interessant er anfald og lammelse adfærd observeres ved temperaturer (~ 34 – 37 ° C) under den nederste ende af den nociceptive tærskel observeret med den varme probe indikerer, at den globale stimulation kan involvere summering af neuronale reaktioner, der er tilstrækkelige til at udløse opførsel med lokal anvendelse af varme probe. At disse temperaturer faktisk opfattes som skadelige for larverne understøttes af den iagttagelse, at larver at begynde lammelse adfærd og derefter lov til at komme på fly fødevarer ikke i de fleste tilfælde overleve (figur 5C). Yderligere støtter det argument, at varmen plspiste assay udlæsning nociceptive responser er det faktum, at blokering synaptisk transmission i kendte nociceptive sensoriske neuroner forøger latensen af de fleste af de observerede adfærd (Figur 6). Den iagttagelse, at der ikke er nogen stigning i latenstid for den højere temperatur piskning adfærd tyder på, at andre sensoriske neuroner, som ikke udtrykker md-Gal4 kan være nødvendig for denne adfærd.
Sammenfattende omfatter begge assays udsætte et individ larve til en skadelig termisk stimulus af definerede temperatur – den varme spidsen af en lille metal-probe i den lokale assay og nedsænkning i en dråbe hurtigt opvarme vandet i den globale assay. Adfærdsmæssige reaktioner af Drosophila larver af varierende genetiske baggrunde og / eller udsættes for varierende miljømæssige betingelser (for eksempel plus eller minus vævsskade), kan studeres og kvantificeret under anvendelse af disse assays. I sidste ende, vil resultaterne fra disse analyser hjælpe os til bedre at forstå genetiske netværk styrer NOCiception i Drosophila og andre beslægtede arter.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Christian Landry for varme sondedesign, Daniel Babcock for udviklingen af larvestadiet varmen sonden analysen, Sean Sweeney for at foreslå den varme plade analysen, det Bloomington Drosophila Stock Center for fluen lagre, og Galko lab medlemmer til kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af NIH R01 NS069828 til MJG og en NIH MARC U-STAR Training Grant (T34GM079088 til University of Houston-Downtown Lærde Academy) for mindretals adgang til forskerkarrierer (AVG).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
Leica DFC290 12v/400mA Color camera |
Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
Schott Ace Modulamp Unit | Schott North America, Inc. | A20500 | |
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
Forceps | FST | FS-1670 | |
1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | |
UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
Microcentrifuge tube | Denville Scientific Inc. | C-2170 |