Multiphoton Microscopie van Gewist Mouse Brain uiten YFP
Summary
Multifoton microscopie van hele muis organen is mogelijk door de clearing optisch orgaan voor beeldvorming, maar niet alle protocollen behouden het fluorescerende signaal van fluorescerende eiwitten. Met behulp van een optische clearing methode met ethanol op basis van uitdroging en benzylalcohol: benzylbenzoaat clearing, tonen we een hoge resolutie multifoton beelden van de hele hersenen van muizen uiten YFP.
Abstract
Multifoton microscopie van intrinsieke fluorescentie en tweede harmonische generatie (SHG) volle muis organen wordt mogelijk gemaakt door de clearing optisch orgaan voor imaging. 1,2 Voor organen die fluorescerende eiwitten zoals GFP en YFP bevatten, optische clearing protocollen die gebruikt methanol uitdroging en duidelijk met behulp van benzylalcohol: benzylbenzoaat (BABB) terwijl onbeschermd tegen het licht 3 niet het behoud van de fluorescerende signaal. Het protocol hier gepresenteerde is een nieuwe manier om gehele orgel optische clearing op de hersenen van muizen uit te voeren met behoud van de fluorescentie signaal van YFP uitgedrukt in neuronen. Wijziging van de optische clearing protocol zodanig dat het orgaan is met een gedehydrateerde ethanol graded serie is gevonden om de schade aan de fluorescerende eiwitten te verminderen en hun fluorescent signaal multifoton imaging behouden. 4 gebruik van een geoptimaliseerde methode van optische clearing met ethanol gebaseerde uitdroging en clearing door BABBterwijl het licht afgeschermde tonen wij hoge resolutie multifoton beelden van geel fluorescent eiwit (YFP) expressie in de neuronen van de hersenen van muizen meer dan 2 mm onder het weefseloppervlak.
Protocol
Discussion
Terwijl de standaard organische kleurstoffen zijn compatibel met een groot aantal organische oplosmiddelen, en dus ook een bijzondere uitdaging geen gevaar voor het opruimen van protocollen, fluorescente eiwitten zijn vaak minder tolerant ten opzichte van veranderingen in oplosmiddel. 4 Het doel van dit werk was om een ernstige beperking van de te overwinnen vorige optische clearing protocollen waar fluorescentie van XFPs verloren is gegaan of zeer veel hinder. De beelden die hier worden gepresenteerd laten z…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Jacob Solis bedanken voor zijn hulp bij videobewerking.
Dit werk werd deels gefinancierd door een NSF Career Award DBI-0953902 aan MJ Levene.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
- Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
- Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
- Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).
