Un test de dépistage fluorescent pour identifier des modulateurs de canaux Girk

Summary

Une procédure de dépistage en temps réel pour identifier les médicaments qui interagissent avec la protéine G-dépendants vers l'intérieur K redresseur⁺ (Girk) canaux est décrite. Le test utilise le potentiel de membrane-colorants fluorescents sensibles pour mesurer l'activité du canal Girk. Cette méthode est adaptable pour une utilisation sur un certain nombre de lignes de cellules.

Abstract

Aux protéines G-dépendants vers l'intérieur de redresseur ^K + (Girk) canaux fonctionnent en tant que médiateurs cellulaires d'un large éventail d'hormones et de neurotransmetteurs et sont exprimés dans le cerveau, le cœur, le muscle squelettique et le tissu endocrinien ^1,2. Canaux Girk sont activés suite à la liaison des ligands (neurotransmetteurs, des hormones, médicaments, etc) pour leur plasma liée à la membrane, couplés aux protéines G (RCPG récepteurs). Cette fixation provoque la stimulation de protéines G (G _i et G _o) qui se lient à la suite et d'activer le canal de Girk. Une fois ouvert le canal Girk permet le mouvement de K ⁺ hors de la cellule provoquant la membrane de repos potentiel pour devenir plus négative. En conséquence, l'activation du canal dans les neurones diminue Girk spontanée formation potentielle d'action et inhibe la libération de neurotransmetteurs excitateurs. Dans le cœur, l'activation du canal Girk inhibe l'activité pacemaker ce qui ralentit le rythme cardiaque.

<pclass = ""> jove_content canaux Girk représentent de nouvelles cibles pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques pour le traitement de la douleur neuropathique, la toxicomanie, les arythmies cardiaques et d'autres troubles ^3. Toutefois, la pharmacologie de ces canaux reste largement inexploré. Bien qu'un certain nombre de médicaments, y compris les agents anti-arythmiques, les médicaments antipsychotiques et les antidépresseurs bloquent le canal Girk, cette inhibition n'est pas sélective et se produit à des concentrations relativement élevées de médicaments ^3.

Ici, nous décrivons un test de dépistage en temps réel pour identifier les nouveaux modulateurs de canaux Girk. Dans cet essai, neuronales AtT20 cellules, exprimant les canaux Girk, sont chargés de potentiel de membrane colorants fluorescents sensibles tels que le bis-(1,3-dibutylbarbituric acide) triméthine oxonol [DiBAC ₄ (3)] ou HLB 021-152 (Figure 1 ). Les molécules de colorant devient fortement fluorescent absorption suivant dans les cellules (Figure 1). Traitementdes cellules avec des ligands GPCR stimule les canaux Girk à ouvrir. Le résultant efflux de K ⁺ hors de la cellule provoque le potentiel de membrane à devenir négative et le signal fluorescent de diminuer (figure 1). Ainsi, les médicaments qui modulent efflux de K ⁺ à travers le canal Girk peut être dosé en utilisant un lecteur de plaque fluorescente. Contrairement à d'autres tests de dépistage d'ions de canal, comme la spectrométrie d'absorption atomique ⁴ ou radiotraceur analyse ^5, le test de canal Girk fluorescente fournit une procédure de dépistage rapide, en temps réel et peu coûteux.

Protocol

1. Préparation des cellules Cultiver l'hypophyse AtT20 cellules dans un milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum de cheval 10% et de maintenir les cultures à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2. Maintenir la culture par repiquage des cellules toutes les 5 à 7 jours en utilisant une procédure standard de traitement à la trypsine. Enrober les puits de noir, fond transparent, des plaques à 96 puits avec 50 pl de poly-L-lysi…

Discussion

Bien que le potentiel de membrane-colorants fluorescents sensibles ont été utilisés pour identifier les médicaments qui modulent les canaux ioniques ^9,10, c'est le premier rapport de leur demande de neurones Girk drogues Discovery Channel. Le test de canal Girk fluorescente présentée ici fournit une méthode rapide, fiable et en temps réel pour le criblage de ligand-dépendants canaux ^K +. Le dosage peut être modifié pour une utilisation avec une large gamme de cellules, y compris des …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM	CellGro	10-013
Horse serum	Invitrogen	16050-114
96-well plates	Corning	3603
Poly-l-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Somatostatin	Sigma-Aldrich	S9129
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382
HLB 021-152	AnaSpec	89300
Versette automated liquid handler	ThermoFisher	650-01
Synergy2 fluorescent plate reader	Biotek
Gen5 analysis software	Biotek

Table 1. Table of specific reagents and equipment.