Ein fluoreszierendes Screening Assay zur Identifizierung von Modulatoren der GIRK Kanäle
Summary
Ein Echtzeit-Screening-Verfahren zur Identifizierung von Medikamenten, die mit G-Protein-gated Einwärtsgleichrichter K interagieren<sup> +</sup> (GIRK) Kanälen beschrieben. Der Test basiert Membranpotential Fluoreszenzfarbstoffe zu GIRK Kanal-Aktivität zu messen. Diese Technik eignet sich sowohl für den Einsatz auf einer Reihe von Zelllinien.
Abstract
G-Protein-gesteuerten K + Einwärtsgleichrichter (GIRK) Kanäle fungieren als zelluläre Mediatoren einer Vielzahl von Hormonen und Neurotransmittern und im Gehirn, Herz, Skelettmuskel und endokrines Gewebe 1,2 ausgedrückt. GIRK Kanäle aktiviert werden nach der Bindung von Liganden (Neurotransmitter, Hormone, Arzneimittel, etc.), um die Plasma-Membran-gebundenen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). Diese Bindung bewirkt, dass die Stimulation des G-Proteine (G i und G o), die anschließend zu binden und aktivieren Sie die GIRK Kanal. Nach dem Öffnen der GIRK Kanal erlaubt die Bewegung von K + aus der Zelle verursacht das Ruhemembranpotential zu mehr negativ. Als Folge davon sinkt GIRK Kanal-Aktivierung in Neuronen spontane Aktionspotential Bildung und hemmt die Freisetzung von exzitatorischen Neurotransmittern. Im Herzen, hemmt die Aktivierung des GIRK Kanal Schrittmacher-Aktivität dadurch eine Verlangsamung der Herzfrequenz.
<pclass = "jove_content"> GIRK Kanäle neuartigen Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Therapeutika für die Behandlung neuropathischer Schmerzen, Drogensucht, Herzrhythmusstörungen und anderen Erkrankungen 3. Allerdings bleibt die Pharmakologie dieser Kanäle weitgehend unerforscht. Obwohl eine Reihe von Medikamenten, einschließlich Antiarrhythmika, Antipsychotika und Antidepressiva die GIRK Kanal blockieren, ist diese Hemmung nicht selektiv und bei relativ hohen Wirkstoffkonzentrationen 3.Hier beschreiben wir eine Echtzeit-Screening-Test zur Identifizierung neuer Modulatoren von GIRK Kanäle. In diesem Assay werden neuronalen AtT20-Zellen, die GIRK Kanäle mit Membranpotential Fluoreszenzfarbstoffe, wie Bis-(1,3-dibutylbarbituric Säure) geladen Trimethin Oxonol [Dibac 4 (3)] oder HLB 021-152 (1 ). Die Farbstoffmoleküle werden stark fluoreszierende folgende Aufnahme in die Zellen (Abbildung 1). Behandlungder Zellen mit GPCR-Liganden stimuliert die GIRK Kanäle zu öffnen. Das resultierende K +-Ausstrom aus der Zelle bewirkt, dass das Membranpotential zu werden negativ und das Fluoreszenzsignal zu verringern (Abbildung 1). So können Medikamente, die K +-Ausstrom modulieren durch den Kanal GIRK untersucht mit Hilfe eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät werden. Im Gegensatz zu anderen Ionenkanal-Screening-Assays, wie Atomabsorptionsspektrometrie 4 oder Radiotracer Analyse 5 stellt die GIRK Kanal Fluoreszenz-Assay einen schnellen, in Echtzeit und kostengünstige Screening-Verfahren.
Protocol
Discussion
Während Membranpotential Fluoreszenzfarbstoffe verwendet wurden, um Medikamente, die Ionenkanäle modulieren 9,10 zu identifizieren, ist dies der erste Bericht über ihre Anwendung für die neuronale GIRK Channel Drug Discovery. Die GIRK Kanal Fluoreszenz-Assay hier vorgestellten bietet eine schnelle, zuverlässige und Echtzeit-Methode für das Screening von Liganden-gesteuerte K +-Kanäle. Der Assay kann zur Verwendung mit einer Vielzahl von Zellen, einschließlich immortalisierten Zelllinien (HE…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom US Public Health Service Award NS-071530 gefördert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | CellGro | 10-013 |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 |
| 96-well plates | Corning | 3603 |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 |
| Versette automated liquid handler | ThermoFisher | 650-01 |
| Synergy2 fluorescent plate reader | Biotek | |
| Gen5 analysis software | Biotek |
Table 1. Table of specific reagents and equipment.
References
- Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
- Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).
- Kobayashi, T., Ikeda, K. G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets. Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).
- Terstappen, G. C. Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay. Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).
- Cheng, C. S. A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look. Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).
- Zhang, J. -. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochem. 37, 13291-13299 (1998).
- Inomata, N. Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes. Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).
- Tang, W. Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel. J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).
- Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays. J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).
- Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).
- Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux. Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).
