En fluoriserende Screening Assay for å identifisere modulatorer av GIRK kanaler
Summary
En sanntid screening prosedyre for å identifisere stoffer som samhandler med G protein-gated innover likeretter K<sup> +</sup> (GIRK) kanaler er beskrevet. Analysen benytter membran potensial-sensitive fluorescerende fargestoffer for å måle GIRK kanal aktivitet. Denne teknikken er tilpasningsdyktig for bruk på en rekke cellelinjer.
Abstract
G protein-gated innover likeretter K + (GIRK) kanaler fungere som cellulære mediatorer av et bredt spekter av hormoner og signalstoffer og er uttrykt i hjernen, hjertet, skjelettmuskulatur og endokrine vev 1,2. GIRK kanaler blir aktivert etter binding av ligander (nevrotransmittere, hormoner, medikamenter osv.) til sin plasma membran-bundet, G protein-koblede reseptorer (GPCRs). Denne bindingen fører til stimulering av G-proteiner (G jeg og G o) som senere binde seg til og aktivere GIRK kanalen. Når åpnet GIRK kanalen tillater bevegelse av K + ut av cellen som forårsaker hviler membran potensial til å bli mer negativ. Som en konsekvens, minsker GIRK kanal aktivering i nevroner spontan handling potensial formasjon og hemmer frigjøring av eksitatoriske nevrotransmittere. I hjertet, hemmer aktivering av GIRK kanalen pacemakeren aktivitet og dermed bremse pulsen.
<pclass = "jove_content"> GIRK kanaler representere nye mål for utvikling av nye terapeutiske agenter for behandling nevropatisk smerte, narkotikaavhengighet, hjertearytmier og andre lidelser tre. Imidlertid fortsatt farmakologi av disse kanalene i stor grad uutforsket. Selv om en rekke medikamenter, inkludert antiarytmiske midler, antipsykotika og antidepressiva blokkere GIRK kanal, er dette hemming ikke selektiv og forekommer ved relativt høye konsentrasjoner narkotika 3.Her beskriver vi en real-time screening test for å identifisere nye modulatorer av GIRK kanaler. I denne analysen, er nevrale AtT20 celler, uttrykker GIRK kanaler, lastet med membranpotensiale-sensitive fluorescerende fargestoffer som bis-(1,3-dibutylbarbituric syre) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] eller HLB 021-152 (Figur 1 ). De fargestoffer blitt sterkt fluoriserende følgende opptak i cellene (Figur 1). Behandlingav cellene med GPCR ligander stimulerer GIRK kanaler for å åpne. Den resulterende K + effluks ut av cellen fører til at membranen potensial til å bli mer negativ og fluorescerende signal å redusere (figur 1). Dermed kan medikamenter som modulerer K + efflux gjennom GIRK kanalen bli analysert ved hjelp av en fluorescerende plateavleseren. I motsetning til andre ionekanal screening-analyser, slik atomabsorpsjonspektrometri 4 eller radiotracer analyse 5, gir GIRK kanalen fluorescerende analysen en rask, real-time og billig screening prosedyre.
Protocol
Discussion
Mens membranpotensiale-sensitive fluorescerende fargestoffer blitt brukt til å identifisere stoffer som modulerer ionekanaler 9,10, er dette den første rapporten om deres søknad om nevronale GIRK kanal legemiddelforskning. Den GIRK kanalen fluorescerende analysen presenteres her gir en rask, pålitelig og real-time metode for screening av ligand-gated K +-kanaler. Analysen kan modifiseres for bruk med et bredt spekter av celler, inkludert udødeliggjorde celler linjer (HEK293, CHO, etc.) som utt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av US Public Health Service Award NS-071530.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | CellGro | 10-013 |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 |
| 96-well plates | Corning | 3603 |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 |
| Versette automated liquid handler | ThermoFisher | 650-01 |
| Synergy2 fluorescent plate reader | Biotek | |
| Gen5 analysis software | Biotek |
Table 1. Table of specific reagents and equipment.
References
- Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
- Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).
- Kobayashi, T., Ikeda, K. G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets. Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).
- Terstappen, G. C. Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay. Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).
- Cheng, C. S. A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look. Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).
- Zhang, J. -. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochem. 37, 13291-13299 (1998).
- Inomata, N. Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes. Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).
- Tang, W. Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel. J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).
- Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays. J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).
- Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).
- Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux. Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).
