En fluorescerande screeningsanalys för att identifiera modulatorer av GIRK kanaler
Summary
En i realtid screening för identifiering läkemedel som interagerar med G-protein-gated inåt likriktare K<sup> ^</sup> (GIRK) kanaler beskrivs. Analysen utnyttjar membranpotentialen-känsliga fluorescerande färgämnen för att mäta GIRK kanalaktivitet. Denna teknik är anpassningsbar för användning på ett antal cellinjer.
Abstract
G-protein-gated inåt likriktartransistorerna K + (GIRK) kanaler fungerar som cellulära mediatorer av en mängd olika hormoner och neurotransmittorer och uttrycks i hjärna, hjärta, skelettmuskel och endokrin vävnad 1,2. GIRK kanaler aktiveras till följd av bindning av ligander (neurotransmittorer, hormoner, läkemedel, etc) till sin plasma membranbunden, G-proteinkopplade receptorer (GPCR). Denna bindning orsakar stimulering av G-proteiner (G ^ och G ^) som därefter binder till och aktiverar GIRK kanalen. När öppnade GIRK kanalen tillåter förflyttning av K + ut ur cellen som orsakar vilande membranpotentialen blir mer negativ. Som en följd minskar GIRK kanalaktivering i neuroner spontan bildning aktionspotential och inhiberar frisättning av excitatoriska neurotransmittorer. I hjärtat hämmar aktivering av GIRK kanalen pacemakern verksamheten och därigenom bromsa hjärtfrekvensen.
<pclass = "jove_content"> GIRK kanalerna utgör nya mål för utvecklingen av nya läkemedel för behandling neuropatisk smärta, drogberoende, hjärtarytmier och andra störningar 3. Dock fortfarande farmakologi av dessa kanaler i stort sett outforskade. Även om ett antal läkemedel inklusive antiarytmiska medel, läkemedel antipsykotiska och antidepressiva medel blockerar GIRK kanal, är denna inhibering inte selektiv och inträffar vid relativt höga läkemedelskoncentrationer 3.Här beskriver vi ett realtid screeningsanalys för att identifiera nya modulatorer av GIRK kanaler. I denna analys är neuronala AtT20 celler, som uttrycker GIRK kanaler, laddad med membranpotential-känsliga fluorescerande färgämnen, såsom bis-(1,3-dibutylbarbituric syra) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] eller HLB 021-152 (figur 1 ). De färgmolekyler bli starkt fluorescerande efter upptag in i cellerna (Figur 1). Behandlingav cellerna med GPCR-ligander stimulerar GIRK kanaler för att öppna. Den resulterande K + utflöde ur cellen orsakar membranet kan bli mer negativ och den fluorescerande signalen för att minska (figur 1). Således kan läkemedel som modulerar K ^-utflöde genom GIRK kanalen skall analyseras med användning av en fluorescerande plattläsare. Till skillnad från andra screening-jonkanal-analyser, som atomabsorptionsspektrometri 4 eller radiotracer analys 5 ger GIRK kanalen fluorescerande analys en snabb, realtid och billigt urvalsförfarande.
Protocol
Discussion
Medan membranpotential-känsliga fluorescerande färgämnen har använts för att identifiera läkemedel som modulerar jonkanaler 9,10, detta är den första rapporten av deras ansökan om neuronal GIRK kanalen läkemedelsutveckling. Den GIRK kanalen fluorescerande analys som presenteras här ger en snabb, pålitlig och i realtid metod för screening av ligand-gated K +-kanaler. Analysen kan modifieras för användning med en mängd olika celler innefattande immortaliserade cellinjer (HEK293, CHO, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av US Public Health Service Award NS-071.530.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | CellGro | 10-013 |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 |
| 96-well plates | Corning | 3603 |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 |
| Versette automated liquid handler | ThermoFisher | 650-01 |
| Synergy2 fluorescent plate reader | Biotek | |
| Gen5 analysis software | Biotek |
Table 1. Table of specific reagents and equipment.
References
- Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
- Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).
- Kobayashi, T., Ikeda, K. G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets. Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).
- Terstappen, G. C. Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay. Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).
- Cheng, C. S. A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look. Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).
- Zhang, J. -. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochem. 37, 13291-13299 (1998).
- Inomata, N. Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes. Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).
- Tang, W. Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel. J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).
- Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays. J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).
- Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).
- Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux. Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).
