Forsøk på å uttrykke den cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) i<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Har, til nå, gitt relativt lave mengder protein. Denne protokollen og de tilhørende reagenser distribueres via Cystisk fibrose Foundation bør tillate utarbeidelse av milligram mengder av dette "vanskelige" eukaryot membran protein.
Cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) er en klorid kanal, at når mutert, kan gi opphav til cystisk fibrose i humans.There er derfor stor interesse i dette proteinet, men arbeidet med å studere sin struktur og aktivitet har vært hemmet av problemer uttrykke og rensende tilstrekkelige mengder protein 1-3. Som mange "vanskelige" eukaryote membran proteiner, er uttrykk i en raskt voksende organisme ønskelig, men utfordrende, og i gjær S. cerevisiae, så langt lave mengder ble innhentet og rask nedbrytning av rekombinant protein ble observert 4-9. Proteiner er involvert i behandlingen av rekombinant CFTR i gjær har blitt beskrevet 6-9. I denne rapporten beskriver vi en metode for uttrykk av CFTR i gjær og rensing i betydelige mengder. Protokollen beskriver hvordan de tidligere proteolyse problemene kan overvinnes og hvordan uttrykket nivåer avCFTR kan bli mye bedre ved å endre cellen vekstbetingelser og ved å kontrollere induksjon forholdene, særlig perioden før celle høsting. De reagants tilknyttet denne protokollen (murine CFTR-uttrykke gjærceller eller gjær plasmider) vil bli distribuert via den amerikanske Cystisk fibrose Foundation, som har sponset forskningen. En artikkel som beskriver design og syntese av CFTR konstruere ansatt i denne rapporten vil bli publisert separat (Urbatsch, I.,. Thibodeau, P. et al, upublisert). I denne artikkelen vil vi forklare vår metode begynner med transformasjon av gjærceller med CFTR konstruere – inneholder gjær plasmid (Fig. 1). Konstruktet har grønt fluoriserende protein (GFP) sekvens smeltet CFTR på sitt C-terminus og følger systemet utviklet av Drew et al. (2008) 10. GFP gir uttrykk og rensing av CFTR skal følges relativt enkelt. Den Jove visualisert protocol ferdig etter utarbeidelsen av mikrosomer fra gjærceller, selv om vi inkluderer noen forslag til rensing av protein fra mikrosomer. Leserne kan ønske å legge til sine egne modifikasjoner på microsome rensing prosedyren, avhengig av endelige eksperimenter som skal utføres med protein og den lokale utstyret tilgjengelig for dem. Den gjær-uttrykte CFTR proteinet kan delvis renset ved hjelp av metall ion affinitet kromatografi, ved hjelp av en iboende polyhistidine rensing tag. Etterfølgende størrelse utestenging kromatografi gir et protein som synes å være> 90% ren, som bedømt av SDS-PAGE og Coomassie-farging av gel.
Denne artikkelen gir en metode for uttrykket av murine CFTR proteinet i gjærceller, som skal lette forskning på cystisk fibrose. Målet er å knytte dette papiret med utgivelsen av den murine CFTR DNA konstruksjon, som vil være tilgjengelig via Cystisk fibrose Foundation ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Andre orthologs bør bli tilgjengelig senere. Transformasjon av gjærceller med CFTR-inneholder vektor er grei, men det er viktig å screene for kolonier uttrykker høye nivåer av CFTR. Variable uttrykk nivåer kan oppstå fra flere faktorer, men antall kopier av plasmidet per celle trolig står for en betydelig grad av variasjon. Kritiske trinn beskrives her bør tillate produksjon av CFTR-uttrykkende gjærceller og CFTR-inneholder mikrosomale membraner. Når transformasjon, vekst, høsting og lysis av gjærceller har blitt mestret, purification av proteinet bør være mulig, og i figur 3 har vi gitt et eksempel på renhet som bør være oppnåelig i dette tilfellet som en nyttig målestokk. Det er ikke vår intensjon i dette manuskriptet for å gi detaljert metode for rensing av protein. Det er imidlertid noen viktige nedstrøms renseanlegg trinn som er spesifikke for S.cerevisae uttrykk system, slik som cellelyse og microsome rensing, og disse er inkludert i detalj i dette manuskriptet. Det bør nevnes imidlertid at bortsett fra de to metodene vi har brukt, kan alternative gjærcelle avbrudd metoder benyttes, for eksempel bruk av en fransk press celle. Den rekombinant protein har en TEV-cleavable C-terminal GFP domene som gjør at proteinet spores etter induksjon (Fig. 4). Gjær har en iboende 70kDa protein (sannsynligvis succinate dehydrogenase 12) som fluoresces under samme vilkår 11, og dette kan gi en nyttig interNAL kalibrering standard for de relative uttrykk nivåer av CFTR i helcelle ekstrakter eller mikrosomer (Fig. 3). Det er klart fra data vist i figur 4 at tidspunktet for cellen høsting etter induksjon med galaktose er avgjørende. Avlingene av CFTR fall bratt etter ca 16 timer av induksjon, slik at det er knapt noen påvisbar CFTR i gjærceller etter 24 timer av induksjon.
Utbyttet av renset protein er om 1-2mg CFTR protein per 15 liter fermentering kultur. Recovery kan beregnes som ca 70% av den totale CFTR-GFP protein opp til microsome scenen, og ca 25% gjenvinning av renset protein. Karakterisering av S. cerevisiae-uttrykte CFTR pågår. Som sett i fig. 4, kan proteinet plassering i cellen bli overvåket av fluorescens mikroskopi. Selv om mye av fluorescens er funnet rundt periferien av cellen som forventet 10, viser noe av det proteinet en punktformet lokalisering, enten i, ellerbare inne i plasmamembranen som kan skyldes CFTR resirkulering gjennom en sen Golgi / endosomal gangsti 14 eller kanskje et rom nedstrøms den spirende av transport vesikler fra ER 4. Behandling med PNGaseF, et enzym som deglycosylates proteiner, viste minimal endring i migrasjon av CFTR proteinet bandet på SDS-PAGE, noe som tyder på at det er unglycosylated, eller har minimal glykosylering 15. Eksperimenter på fosforylering tilstand av proteinet er underveis. I noen av vaskemidler testet så langt, viser renset protein ATPase aktivitet (som er hemmet av en CFTR-spesifikk hemmer 16) på priser som er lik de tidligere publisert 2,15. Måling av CFTR kanal aktivitet vil kreve oppløsning av det renset protein, noe som ville innebære en endelig rensingen i et vaskemiddel som har en relativt høy kritisk miceller konsentrasjon (CMC) 17. Gjær mikrosomer containing CFTR kan solublised med flere vanlige arbeidstakere vaskemidler 18, inkludert rengjøringsmidler som dodecyl 2 maltoside, som er generelt ansett for å være "mild". Men de fleste høye CMC vaskemidler har vist seg å være ineffektiv for solubilsation, så langt, tyder på at utveksling til disse midlene bør vurderes på et sent stadium i noen rensing ordningen.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Cystisk fibrose Foundation (CFF) for å finansiere dette arbeidet gjennom sin CFTR 3D Structure Consortium (stipend nummer FORD08XX0). Vi erkjenner den store bidrag fra alle våre kolleger i konsortiet til dette arbeidet, spesielt i utformingen av CFTR gener. Vi erkjenner også de uvurderlige bidrag fra legene. James Birtley (NCSR Demokritos, Hellas), Mark Young (University of Cardiff, Storbritannia) og David Drew (Imperial College, London, Storbritannia) i de tidlige stadier av arbeidet. Vi vil spesielt takke dr. Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) for kritisk lesing av manuskriptet.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue No |
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | ||
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 |
Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 |
D-galactose | Fisher | BP656-500 |
D-glucose | Fisher | D16-500 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Tris-HCl | Fisher | P631 |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
Glycerol | Fisher | 065017 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 |
Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 |
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 |
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | |
Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Vortex mixer | Star Labs | |
Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 |
LAS3000 imaging system | Fuji | |
20l fermenter vessel and control unit | Applikon | |
Constant systems cell disrupter | Constant systems | |
Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 |
JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |