Försök att uttrycka den cystisk fibros transmembran konduktans (CFTR) in<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Har hittills gett relativt små mängder protein. Detta protokoll och de tillhörande reagenser distribueras via cystisk fibros stiftelsen bör göra det möjligt att förbereda milligram mängder av denna "svåra" eukaryot membranprotein.
Cystisk fibros transmembran konduktans-regulator (CFTR) är en klorid-kanal, att när muterade, kan ge upphov till cystisk fibros i humans.There är därför ett stort intresse för detta protein, men arbetet med att studera dess struktur och aktivitet har hindrats av svårigheten att uttrycka och rena tillräckliga mängder av proteinet 1-3. Liksom många "svår" eukaryota membranproteiner, är uttryck i ett snabbt växande organism önskvärt, men utmanande, och i jästen S. cerevisiae, som hittills låga mängder erhölls och snabb nedbrytning av det rekombinanta proteinet observerades 4-9. Proteiner involverade i behandlingen av rekombinant CFTR i jäst har beskrivits 6-9. I denna rapport beskriver vi en metod för uttryck av CFTR i jäst och rening i betydande mängder. Protokollet beskriver hur de tidigare proteolys problem kan lösas och hur nivåer uttryck avCFTR kan förbättras avsevärt genom att modifiera de villkor cell tillväxt och genom att kontrollera induktion villkor, särskilt den tid före cellen skörd. De reagants förknippade med detta protokoll (mus CFTR-uttryckande jästceller eller plasmider jäst) kommer att distribueras via USA cystisk fibros Foundation, som har sponsrat forskningen. En artikel som beskriver utformning och syntes av CFTR konstruktion som används i denna rapport kommer att publiceras separat (Urbatsch, I.,. Thibodeau, P. et al, opublicerad). I denna artikel kommer vi att förklara vår metod börjar med omvandlingen av jästcellerna med CFTR bygger – som innehåller jästplasmid (Fig. 1). Konstruktionen har en grönt fluorescerande protein (GFP)-sekvens fusionerad till CFTR vid sin C-terminus och följer det system som utvecklats av Drew et al. (2008) 10. GFP tillåter expression och rening av CFTR följas relativt lätt. Jové visualiserades protokollol slutar efter beredning av mikrosomer från jästceller, även om vi inkluderar några förslag för rening av proteinet från mikrosomer. Läsarna kanske vill lägga till sina egna ändringar i mikrosom reningsförfarandet, beroende på de slutliga försöken som skall genomföras med proteinet och den lokala utrustning som finns tillgänglig för dem. Den jästuttryckt CFTR-protein kan renas partiellt med användning av metalljon affinitetskromatografi med användning av en inneboende tagg polyhistidin rening. Efterföljande size exclusion kromatografi ger ett protein som förefaller vara> 90% ren såsom bedömdes genom SDS-PAGE och Coomassie-färgning av gelén.
Detta papper tillhandahåller en metod för expression av murint CFTR-protein i jästceller, vilket bör underlätta forskning på cystisk fibros. Målet är att koppla detta papper med lanseringen av den murina CFTR DNA-konstruktionen, som kommer att vara tillgängliga via cystisk fibros Foundation ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Andra ortologer bör bli tillgänglig senare. Transformation av jästceller med CFTR-vektorn är okomplicerad, men det är viktigt att screena för kolonier som uttrycker höga nivåer av CFTR. Variabla uttrycksnivåer kan uppstå av flera faktorer, men antalet kopior av plasmiden per cell förmodligen står för en betydande grad av variation. Kritiska steg som beskrivs här bör göra det möjligt produktion av CFTR-uttryckande jästceller och CFTR-innehållande mikrosomala membran. När omvandling, tillväxt, skörd och lys av jästceller har bemästrat, Purifblue av proteinet bör vara möjligt, och i Figur 3 har vi gett ett exempel på renhet som bör kunna uppnås i detta fall som ett användbart riktmärke. Det är inte vår avsikt detta manuskript för att ge detaljerad metod för rening av proteinet. Det finns dock några viktiga nedströms reningssteg som är specifika för S.cerevisae uttrycket, såsom cell-lys och mikrosom rening, och dessa har tagits med i detalj i detta manuskript. Det bör emellertid nämnas att, bortsett från de två metoderna som vi har använt, kan alternativa jäst cellsönderdelning metoder användas, såsom användning av en fransk tryckcell. Det rekombinanta proteinet har en TEV-klyvbar C-terminala GFP domän som tillåter att proteinet som skall spåras efter induktion (Fig. 4). Jäst har en inneboende 70 kDa protein (förmodligen succinatdehydrogenas 12) som fluorescerar under samma villkor 11, och detta kan ge ett användbart blandNal kalibreringsstandard för de relativa expressionsnivåerna för CFTR i hela cellextrakt eller mikrosomer (fig. 3). Det framgår klart av de data som visas i figur 4 att tidsanpassningen för cellskörd efter induktion med galaktos är avgörande. Utbyten av CFTR droppe förhastat efter ungefär 16 timmar av induktion, så att det är knappt någon påvisbar CFTR i jästceller efter 24 timmars induktion.
Utbytet av renat protein är ca 1-2mg CFTR-protein per 15 liters fermentor kultur. Återvinning kan uppskattas som ca 70% av den totala CFTR-GFP-proteinet upp till mikrosom steget och omkring 25% återvinning av renat protein. Karakterisering av S. cerevisiae-uttryckt CFTR pågår. Såsom ses i FIG. 4, kan proteinets lokalisering i cellen övervakas genom fluorescensmikroskopi. Även om mycket av fluorescens hittas runt periferin av cellen som förväntat 10 visar en del av proteinet en punktformig lokalisering, antingen i ellerbara inuti plasmamembranet som skulle kunna bero på CFTR återvinns med hjälp av en sent Golgi / endosomala reaktionsvägen 14 eller kanske en nedströmskammare av knoppning av transport vesiklar från ER 4. Behandling med PNGasF, ett enzym som deglycosylates proteiner visade minimal förändring av migreringen av CFTR-proteinet på SDS-PAGE, vilket tyder på att det är oglykosylerat, eller har minimal glykosylering 15. Experiment på fosforyleringstillståndet för proteinet är på gång. I vissa av de detergenter som testats hittills, uppvisar det renade proteinet ATPas-aktivitet (som inhiberas av en CFTR-specifik hämmare 16) vid hastigheter som är jämförbara med de som tidigare publicerats 2,15. Mätning av CFTR-kanalaktivitet kräver rekonstituering av det renade proteinet, vilket skulle innebära ett slutligt reningssteg i en detergent som har en relativt hög kritisk micellkoncentration (CMC) 17. Jäst mikrosomer containing CFTR kan solublised med flera vanligen använda rengöringsmedel 18, inklusive detergenter såsom dodecyl maltosid 2, som allmänt anses vara "mild". Men de flesta höga CMC rengöringsmedel har visat sig vara ineffektivt för solubilsation hittills tyder på att utbytet i dessa rengöringsmedel bör betraktas på ett sent stadium i någon rening system.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar cystisk fibros Foundation (CFF) för att finansiera detta arbete genom sitt CFTR 3D Structure Consortium (licensnummer FORD08XX0). Vi erkänner den enorma bidrag från alla våra kolleger inom konsortiet till detta arbete, särskilt i utformningen av CFTR gener. Vi erkänner också ovärderliga bidrag Dr. James Birtley (NCSR Demokritos, Grekland), Mark Young (University of Cardiff, Storbritannien) och David Drew (Imperial College, London, Storbritannien) i ett tidigt skede av arbetet. Vi tackar särskilt Dr Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) för kritisk läsning av manuskriptet.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue No |
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | ||
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 |
Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 |
D-galactose | Fisher | BP656-500 |
D-glucose | Fisher | D16-500 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Tris-HCl | Fisher | P631 |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
Glycerol | Fisher | 065017 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 |
Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 |
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 |
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | |
Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Vortex mixer | Star Labs | |
Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 |
LAS3000 imaging system | Fuji | |
20l fermenter vessel and control unit | Applikon | |
Constant systems cell disrupter | Constant systems | |
Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 |
JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |