Odorant-induzierten Reaktionen aus olfaktorischen Rezeptor-Neuronen mit der Saugpipette Technik aufgenommen

Summary

Olfaktorische Rezeptor-Neuronen (ORN) zu konvertieren Geruchs-Signale zunächst in einem Rezeptor Strom, wiederum löst Aktionspotentiale, die bis zur zweiten Ordnung Neuronen im Riechkolben gefördert werden. Hier beschreiben wir die Saugpipette Technik gleichzeitig aufzeichnen Duftstoff-induzierte Rezeptor-Strom-und Aktionspotentiale aus Maus ORN.

Abstract

Tiere probieren Sie die Geruchsstoffe Umwelt um sie herum durch die chemosensorischen Systemen in der Nasenhöhle befindet. Chemosensorische Signale beeinflussen komplexe Verhaltensweisen wie die Wahl der Lebensmittel, Raubtier, Artgenossen und Mate Anerkennung und anderen gesellschaftlich relevanten Hinweisen. Olfaktorische Rezeptor-Neuronen (ORN) im dorsalen Teil der Nasenhöhle im olfaktorischen Epithel eingebettet. Diese bipolare Nervenzellen senden Sie eine Axon zum Riechkolben (siehe Abb. 1, Reisert & Zhao ^1, ursprünglich im Journal of General Physiology veröffentlicht) und Erweiterung eines einzigen Dendriten der epithelialen Grenze, von wo aus Zilien strahlt in den Schleim, der die olfaktorische deckt Epithel. Die Flimmerhärchen enthalten die Signaltransduktion Maschinen, die letztlich zu aktuellen Einstrom durch den ciliary Transduktion Kanälen, zyklisch Nukleotid-gesteuerten (CNG)-Kanal und einem Ca ^{2 +-aktivierten} Cl exzitatorischen ^– Kanal (Abb. 1). Die anschließende depolarization löst Aktionspotential Generation am Zellkörper ^2-4.

In diesem Video beschreiben wir die Verwendung des "Saugpipette Technik", um Duftstoff-induzierten Reaktionen von ORN aufnehmen. Diese Methode wurde ursprünglich entwickelt, um aus Stäbchen-Photorezeptoren ⁵ aufnehmen und eine Variante dieser Methode können jove.com modifiziert, um von der Maus Zapfen-Photorezeptoren ⁶ aufzeichnen gefunden werden. Die Saugpipette Technik wurde später auch angepasst ist, um aus ^7,8 ORN aufzuzeichnen. Kurz nach der Dissoziation des olfaktorischen Epithel und Zellisolation wird die gesamte Zelle Körper eines ORN in die Spitze einer Pipette angesaugt Aufzeichnung. Die Dendriten und die Zilien frei bleiben der Badlösung und somit zugänglich Lösung Änderungen an zB Geruchsstoff oder pharmakologische Blocker-Anwendung zu ermöglichen. In dieser Konfiguration wird kein Zugriff auf die intrazelluläre Umgebung gewonnen (kein Ganzzell-Spannungsklammer) und die intrazelluläre Spannung bleibt frei zu variieren. Dies allesverdankt die gleichzeitige Aufnahme der langsamen Rezeptor-Strom, der an der Zilien und schnelles Handeln Potenziale durch den Zellkörper ⁹ abgefeuert stammt. Der Unterschied in der Kinetik zwischen diesen beiden Signalen ermöglicht ihnen getrennt mit verschiedenen Filtereinstellungen werden. Diese Technik kann auf jedem Wildtyp oder Knockout-Maus verwendet werden oder selektiv aufzuzeichnen aus ORN, die GFP exprimieren auch an spezifische Teilmengen von ORN kennzeichnen, z. B. die Expression eines bestimmten Rezeptors oder Geruchsstoff Ionenkanal.

Protocol

Ein. Die Recording Setup Aufzeichnungsverfahren Kammer auf einem Nikon Eclipse-TE2000U Inversmikroskop mit Phasenkontrast Optik, die auf einer Luft Tisch ausgestattet ist und elektrisch abgeschirmten Verwendung einer Faraday-Käfig angebracht. Die Plexiglas Aufnahme Kammer besteht aus zwei Abschnitten teilweise durch eine Barriere getrennt und klebte auf einem silanisierten Glasobjektträger. Ein Abschnitt der Kammer verwendet wird, um die Zellen absetzen, während der andere für Stimulus-Exp…

Discussion

<p class="jove_content"> Die Saugpipette Technik ist eine elektrophysiologische Methode, die verwendet werden, um den Geruch-induzierten langsamen Rezeptorstrom und die schnelle biphasische Aktionspotentiale aus einem ORN gleichzeitig aufzuzeichnen. Da der Plasmamembran der Zelle nicht verletzt wird, verlässt dieses Verfahren den intrazellulären Milieu ungestörten sicherzustellen, dass die Antworten nicht Odorans verändert aufgrund von Änderungen der cytoplasmatischen Ionenkonzentrationen oder Verdünnung von intrazellulären Faktoren. …

Materials

Name of the material	Type	Company	Catalogue / Model number	Comments
Air table	equipment	Newport
Air Pump	equipment	Newport	ACGP
Pipette Puller	equipment	Sutter	P-97
Borosilicate glass	equipment	WPI	1B150-4
Nikon Eclipse Inverted microscope	equipment	Nikon	TE2000U	Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least
Amplifier PC-501A	equipment	Warner	64-0008	Headstage 1 GΩ
Diamond knife	Equipment	Custom-made
Digitizer Mikro1401 A/D	equipment	Cambridge Electronic Design
Filter unit 3382	equipment	Krohn Hite corporation
Signal	software	Cambridge Electronic Design
Molded Ag/AgCl Pellet	equipment	WPI	64-1297
Pipette holder	equipment	Warner	64-0997	Custom modified to fit headstage
Recording chamber	Equipment	Custom-made
Micromanipulator MP85-1028	equipment	Sutter Instrument	Micromanipulator MP85-1028
Mineral oil	Solution	Sigma	330779-1L
Oscilloscope TDS 1001	equipment	Tektronix
Three-barreled square glass tube	Equipment	Warner	64-0119	0.6 mm ID , 5 cm long
Valve	equipment	The Lee Company
Valvelink 8.2	equipment	Automate Scientific
SF-77B Perfusion fast step	equipment	Warner