정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지
Summary
양적 실시간 중합 효소 사슬 반응 (qPCR)는 종양 샘플에서 여러 microRNA의 표현 수준 (miRNA) 분자를 조사하기 위해 신속하고 민감한 방법입니다. 다른 miRNA 분자의 수백이 메서드 표현식을 사용하면, 증폭 계량, 같은 cDNA 템플릿에서 분석할 수 있습니다.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs)는 단일 좌초된, 18-24 염기 길이 비 코딩 RNA 분자입니다. 그들은 개발 1, apoptosis 2 및 세포주기 조절 3를 포함해 거의 모든 세포 과정에 관여하고 있습니다. MiRNAs들은 목표 메신저 RNAs (mRNAs) 5에 바인딩하여 4 인간 유전자의 90 %에 30 %의 표현을 조절하는 것으로 추정된다. miRNAs의 전역 dysregulation는 다양한 질환 및 암 subtypes 6에서보고되었습니다. 그들의 유행과 독특한 구조로 인해,이 작은 분자 생체 치료, 대리인 및 / 또는 타겟의 차세대 될 것 같다.
miRNA 발현을 조사하는 데 사용되는 방법은 SYBR 녹색 나는 염료 기반뿐만 아니라 Taqman-탐침 기반 qPCR을 포함합니다. miRNAs 효과적으로 임상 환경에서 사용할 수있다면 그것은 신선 및 / 또는 보관된 임상 시료에서의 검색이 정확하고 재현성 및 SP가 될 게 급선무다ecific. qPCR 널리 같은 microarray 연구 7과 전체 게놈 분석의 miRNAs의 표현 검증에 사용되고 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 샘플은 임상화된 전립선암에 대한 급진적인 prostatectomy을 받았습니다 환자에서 있었다, 그러나 다른 조직과 세포 라인 스냅인 냉동는 절제술 후 액체 질소에 있던 전립선 표본 들여 대체하실 수 있습니다. 임상 변수와 각각의 환자에 대한 후속 정보는 이후의 분석 8시 수집되었다.
전립선 종양 샘플에 miRNA 수준의 부량. 종양의 qPCR 분석의 주요 단계는 다음과 같습니다 miRNA 특정 primers를 사용하여 총 RNA 추출, cDNA 합성 및 qPCR 제품의 탐지. mRNA, miRNA 및 기타 작은 RNAs를 포함 총 RNA는 TRIzol 시약을 사용하여 표본에서 추출되었다. Qiagen의 miScript 시스템은 cDNA 합성 및 qPCR를 (그림 1)를 수행하는 데 사용되었다. 내생 miRNAs는 PO 없습니다역방향 전송 과정에서 따라서 lyadenylated, 폴리 (A) 중합 효소는 miRNA를 polyadenylates. miRNA는 oligo-DT 및 역방향 Transcriptase를 사용하여 cDNA 합성하는 템플릿으로 사용됩니다. oligo-DT primers의 5 '끝에 보편 태그 시퀀스가 PCR 단계에서 cDNA의 증폭을 용이하게합니다. PCR 제품의 증폭은 SYBR 녹색, 이중 좌초된 DNA에 intercalates 염료에 의해 방출되는 형광의 수준에 의해 감지된다. 유니버설 태그 시퀀스에 바인딩 범용 프라이머와 함께 특정 miRNA의 primers는 특정 miRNA 시퀀스를 증폭합니다.
miScript 프라이머의 Assays는 만 이상의 사람이 특정 miRNAs와 murine 특정 miRNAs 수백 수 있습니다. 상대 부량 방법은 miRNAs의 표현을 수량 여기에 사용되었습니다. 다른 샘플 사이 다양성에 대한 해결하려면 대상 miRNA의 발현 수준은 참조 유전자의 발현 수준으로 정규화됩니다. GE의 선택NE 분석의 상대적인 양을 정함 방식의 중요한 목표의 표현을 정상화하는하는입니다. 일반적으로이 용량에 사용된 참조 유전자의 예로는 그들이 안정적으로 대부분의 샘플을 통해 표현되는 것으로 간주되는대로 작은 RNAs의 RNU6B, RNU44 및 RNU48 있습니다. 이 프로토콜에서는 RNU6B는 참조 유전자로 사용됩니다.
Protocol
Discussion
일부 miRNAs의 탈선 표현은 일관되게 정상 조직 10, 그리고 이러한 miRNAs 중 일부는 전립선 암의 11에 대한 잠재적인 새로운 치료 대리인으로 명명되었습니다에 비해 전립선 종양에서 발견되었습니다. 따라서 miRNAs의 탈선 표현 수준은 유용한 진단 및 / 또는 전조 생체 자료가 될 수 있습니다. 여기서 제시 실시간 qPCR 방법론은 전립선 종양 조직에서 miRNA 수준의 정확한 양을 정함 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 캐나다 암 학회 연구원 추진하는 사업, 아무도 부여 없습니다. 019,038.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche | |
| Light Cycler Capillaries | Roche | 04929292001 |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | 2538 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
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