الخلوي تنشيط حصاد الضامة السنخية الفئران وتقييم المستحث بواسطة النانوية Polyanhydride
Summary
هنا، نحن تصف بروتوكولات لحصاد الضامة السنخية الفئران، التي يقيمون الخلايا المناعية الفطرية في الرئة، ودراسة تفعيل استهلاكهم في استجابة لثقافة بالتعاون مع النانوية polyanhydride.
Abstract
ظهرت النانوية القابلة للتحلل كمنصة متعددة لتصميم وتنفيذ اللقاحات الجديدة داخل الأنف ضد الأمراض المعدية في الجهاز التنفسي. على وجه التحديد، polyanhydride النانوية المؤلفة من حمض sebacic الأليفاتية (SA)، والعطرية 1،6 مكرر (ف carboxyphenoxy) الهكسين (CPH)، أو amphiphilic 1،8 مكرر (ف carboxyphenoxy) -3،6-dioxaoctane (CPTEG) عرض الجزء الأكبر حركية فريدة من نوعها وتآكل سطح 1،2 ويمكن استغلالها لاطلاق سراح ببطء الجزيئات الحيوية وظيفي (على سبيل المثال، المضادات البروتين، والمناعية وغيرها) في الجسم الحي 3،4،5. هذه الجسيمات النانوية أيضا تمتلك نشاط المواد المساعدة الذاتية، مما يجعلها خيارا ممتازا لقاح منصة تسليم 6،7،8.
من أجل إلقاء الضوء على الآليات التي تحكم تنشيط المناعة الفطرية بعد التطعيم المخاطية داخل الأنف، لا بد من تقييم الاستجابات الجزيئية والخلوية في ص مستضدامتعض خلايا (ناقلات الجنود المدرعة) المسؤولة عن الشروع في الاستجابات المناعية. الخلايا الجذعية هي ناقلات الجنود المدرعة الرئيسية وجدت في إجراء الخطوط الجوية القطرية، في حين الضامة السنخية (AMɸ) هي السائدة في لحمة الرئة 9،10،11. AMɸ ذات كفاءة عالية في تنظيف الرئتين من مسببات الأمراض الميكروبية وحطام خلية 12،13. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا نوع من الخلايا تلعب دورا هاما في نقل مولدات المضادات الجرثومية إلى الغدد الليمفاوية استنزاف، والذي هو خطوة أولى مهمة في بدء الاستجابة المناعية التكيفية 9. AMɸ أعرب أيضا عن مستويات مرتفعة من نمط الاعتراف الفطرية ومستقبلات زبال، وسطاء تفرز الموالية للالتهابات، ورئيس والخلايا التائية السذاجة 12،14. ويمكن بسهولة ان سكان نقي نسبيا من AMɸ (على سبيل المثال، أكبر من 80٪) يمكن الحصول عليها عن طريق غسيل الرئة للدراسة في المختبر. مقيم تحصد AMɸ من الحيوانات المختصة المناعي توفير النمط الظاهري ممثل الضامة التي من شأنها أن encounteص لقاح الجسيمات المستندة في الجسم الحي. هنا، نحن تصف البروتوكولات المستخدمة لموسم الحصاد والثقافة AMɸ من الفئران ودراسة النمط الظاهري تفعيل الضامة بعد العلاج مع النانوية polyanhydride في المختبر.
Protocol
Discussion
وقد أظهرت منصات Polyanhydride جسيمات متناهية الصغر لقاح فعالية عندما تدار الأنف في نظم جرعة واحدة 5. قياس تفعيل السكان الخلية البلعمية المقيمين في الرئتين الناجمة عن هذا اللقاح منصة تسليم تصاريح تقييم قدرتها المحتملة في نهاية المطاف إلى تعزيز الاستجابات المناعية ال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر للبحوث الطبية للقوات المسلحة الامريكية والعتاد القيادة (أرقام المنح W81XWH-09-1-0386 وW81XWH-10-1 0806-) للحصول على الدعم المالي والدكتور شون ريجبي من مرفق جامعة ولاية ايوا التدفق الخلوي لل له المساعدة من الخبراء التقنيين.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phycoerythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½” Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher | 138082 | |
| Forceps | Roboz | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR International | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalgene | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | TPP | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman-Coulter | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman-Coulter | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman-Coulter | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman-Coulter | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 |
References
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642 (2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
- Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
- Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
- Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
- Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4 (2003).
