Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced
Summary
Hier beschreiben wir Protokolle zum Ernten von murinen Alveolarmakrophagen, die ihren Sitz angeborenen Immunsystems Zellen in der Lunge und Prüfung ihrer Aktivierung in Reaktion auf Co-Kultur mit Polyanhydrid Nanopartikel.
Abstract
Biologisch abbaubare Nanopartikel als vielseitige Plattform für die Konzeption und Umsetzung von neuen intranasale Impfstoffe gegen respiratorische Infektionskrankheiten aufgetaucht. Insbesondere Nanopartikel Polyanhydrid aus der aliphatischen Sebacinsäure (SA), das aromatische 1,6-Bis (p-carboxyphenoxy) hexan (BER), oder die amphiphilen 1,8-Bis (p-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctan (CPTEG) haben einzigartige Masse und Oberflächenerosion Kinetik 1,2 und kann genutzt werden, um langsam freisetzen funktionelle Biomoleküle (zB Protein-Antigene, Immunglobuline, usw.) sind in vivo 3,4,5 werden. Diese Nanopartikel besitzen auch intrinsische Adjuvans-Aktivität, so dass sie eine ausgezeichnete Wahl für einen Impfstoff-Delivery-Plattform 6,7,8.
Um die Mechanismen für die Aktivierung der angeborenen Immunität nach intranasaler Schleimhaut Impfung aufzuklären, muss man beurteilen, die molekularen und zellulären Reaktionen des Antigens pübelnehmend Zellen (APC) verantwortlich für die Initiierung Immunantworten. Dendritische Zellen sind die wichtigsten APCs in leitenden Atemwege vor, während Alveolarmakrophagen (AMɸ) im Lungenparenchym 9,10,11 überwiegen. AMɸ sind hoch effizient bei der Räumung in die Lunge von mikrobiellen Krankheitserregern und Zelltrümmer 12,13. Darüber hinaus spielt dieser Zelltyp eine wertvolle Rolle bei der Beförderung von mikrobiellen Antigenen zu den Lymphknoten, die ein wichtiger erster Schritt bei der Initiation einer adaptiven Immunantwort 9 ist. AMɸ auch zum Ausdruck bringen erhöhte Werte von angeborenen Mustererkennung und Scavenger-Rezeptoren, sezernieren pro-inflammatorischen Mediatoren und prime naiven T-Zellen 12,14. Ein relativ reine Population von AMɸ (z. B. größer als 80%) kann ebenfalls in Lungenspülung für Studie im Labor erhalten werden. Wohnhaft AMɸ von immunkompetenten Tieren geerntet werden einen repräsentativen Phänotyp der Makrophagen, wird encounter die Partikel-basierten Impfstoff in vivo. Hier beschreiben wir die Protokolle verwendet werden, um Ernte und Kultur AMɸ von Mäusen zu untersuchen und die Aktivierung der Makrophagen-Phänotyp nach Behandlung mit Polyanhydrid Nanopartikel in vitro.
Protocol
Discussion
Polyanhydrid Nanopartikel-Impfstoff-Plattformen haben die Wirksamkeit gezeigt, wenn intranasal in einzelnen Dosierungen 5 verwaltet. Messung der Aktivierung der ansässigen phagozytischen Zellpopulationen in der Lunge durch diesen Impfstoff induziert Delivery-Plattform ermöglicht eine Bewertung der potenziellen Fähigkeit, letztlich in der adaptiven Immunantwort.
Insbesondere Ernte Alveolarmakrophagen aus Lungenlavage und behandelt sie mit verschiedenen Formulierungen der Nanopar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten sich an die US Army Medical Research und Materiel Command (Grant Numbers W81XWH-09-1 bis 0386 und W81XWH-10-1-0806) für die finanzielle Unterstützung und danken Dr. Shawn Rigby von der Iowa State University Durchflusszytometrie Facility for seine kompetente technische Unterstützung.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phycoerythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½” Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher | 138082 | |
| Forceps | Roboz | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR International | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalgene | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | TPP | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman-Coulter | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman-Coulter | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman-Coulter | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman-Coulter | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 |
References
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