הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride
Summary
במסמך זה אנו מתארים פרוטוקולים קצירת מקרופאגים מכתשיים Murine, אשר תושבי תאים חיסוניים מולדים בריאה, ובדיקת ההפעלה שלהם כתגובה לתרבות בשיתוף עם חלקיקים polyanhydride.
Abstract
חלקיקים מתכלה צמחו כפלטפורמה צדדי על התכנון והיישום של אפי חיסונים חדשים כנגד מחלות זיהומיות בדרכי הנשימה. באופן ספציפי, polyanhydride חלקיקים מורכב חומצה sebacic aliphatic (SA), ארומטי 1,6-bis (p-carboxyphenoxy) הקסאן (CPH), או amphiphilic 1,8-bis (p-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) להציג בתפזורת ייחודי סחף קרקע קינטיקה 1,2 וניתן לנצל לשחרר באיטיות ביומולקולות תפקודית (למשל, אנטיגנים, נוגדנים חלבון וכד ') in vivo 3,4,5. אלו חלקיקים גם בעלי פעילות משלים מהותי, מה שהופך אותם בחירה מצוינת עבור פלטפורמת אספקת החיסון 6,7,8.
על מנת להבהיר את המנגנונים השולטים ההפעלה של חסינות מולדת בעקבות החיסון הרירית אפי, יש להעריך את התגובות מולקולרית תאית של p אנטיגןתאים כועס (נגמ"שים) אחראית ליזום התגובה החיסונית. התאים הדנדריטים הם נגמ"שים העיקריים שנמצאו בניהול דרכי הנשימה, בעוד מקרופאגים מכתשיים (AMɸ) שולטים parenchyma ריאות 9,10,11. AMɸ הם היעילה ביותר בניקוי הריאות של פתוגנים חיידקים ופסולת תא 12,13. בנוסף, זה סוג תא יש תפקיד חשוב בהובלה של אנטיגנים של חיידקים אל קשרי הלימפה וניקוז, וזה צעד ראשון חשוב בייזום של תגובה חיסונית אדפטיבית 9. AMɸ גם מביעים רמות גבוהות של זיהוי תבניות מולדות קולטנים זבל, מפרישים Pro דלקת מתווכים, וראש ותאי T נאיבי 12,14. האוכלוסייה טהורה יחסית של AMɸ (למשל, יותר מ 80%) יכול בקלות להיות מושגת באמצעות שטיפה ריאות למחקר במעבדה. תושב שנקטפו AMɸ מבעלי חיים המוסמכות החיסונית לספק הפנוטיפ מייצג של מקרופאגים אשר encounter חיסון החלקיקים מבוסס in vivo. במסמך זה אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים הקציר ותרבות AMɸ מעכברים ולבדוק את הפנוטיפ הפעלה של מקרופאגים לאחר הטיפול עם חלקיקים polyanhydride במבחנה.
Protocol
Discussion
Nanoparticle Polyanhydride פלטפורמות החיסונים הראו יעילות כאשר מנוהל intranasally ב משטרי מינון יחיד 5. מדידת ההפעלה של אוכלוסיות תאים מקומיים phagocytic של הריאות הנגרמת על ידי אספקת פלטפורמה זו מאפשרת חיסון הערכת היכולת הפוטנציאלית שלה בסופו של דבר לקדם את המערכת החיסונית אדפטיבי?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות צבא ארה"ב למחקר רפואי ואמצעי פיקוד (במדבר גרנט W81XWH-09-1-0386 ו W81XWH-10-1-0806) עבור תמיכה כספית ד"ר שון ריגבי מ מתקן מדינת איווה אוניברסיטת cytometry זרימה עבור מומחה סיוע טכני שלו.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phycoerythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½” Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher | 138082 | |
| Forceps | Roboz | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR International | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalgene | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | TPP | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman-Coulter | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman-Coulter | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman-Coulter | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman-Coulter | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 |
References
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642 (2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
- Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
- Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
- Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
- Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4 (2003).
