La récolte macrophages alvéolaires murins et l'évaluation d'activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride

Summary

Ici, nous décrivons les protocoles pour la récolte des macrophages alvéolaires murins, qui sont des résidents cellules immunitaires innées dans le poumon, et en examinant leur activation en réponse à la co-culture avec des nanoparticules polyanhydride.

Abstract

Nanoparticules biodégradables ont émergé comme une plate-forme polyvalente pour la conception et la mise en œuvre de nouveaux vaccins par voie intranasale contre les maladies respiratoires infectieuses. En particulier, polyanhydride nanoparticules composé de l'acide sébacique aliphatique (SA), l'aromatique 1,6-bis (p-carboxyphénoxy) hexane (CPH), ou l'amphiphile 1,8-bis (p-carboxyphénoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) afficher en vrac unique et cinétique d'érosion de surface ^1,2 et peut être exploitée afin de libérer lentement biomolécules fonctionnelles (par exemple, les antigènes protéiques, des immunoglobulines, etc) in vivo ^3,4,5. Ces nanoparticules possèdent également une activité adjuvante intrinsèque, ce qui les rend un excellent choix pour une plate-forme d'administration des vaccins ^6,7,8.

Afin d'élucider les mécanismes qui régissent l'activation de l'immunité innée après la vaccination muqueuse nasale, il faut évaluer les réponses moléculaires et cellulaires de la p antigènecellules sentant (APC) responsables pour initier des réponses immunitaires. Les cellules dendritiques sont des APC principaux trouvés dans des voies aériennes, tandis que les macrophages alvéolaires (AMɸ) prédominent dans le parenchyme pulmonaire ^9,10,11. AMɸ sont très efficaces dans l'élimination des poumons de pathogènes microbiens et ^12,13 débris cellulaires. En outre, ce type de cellule joue un rôle important dans le transport d'antigènes microbiens vers les ganglions lymphatiques drainant, ce qui est une première étape importante dans l'initiation d'une réponse immunitaire adaptative ^9. AMɸ également exprimer des niveaux élevés de reconnaissance de formes innée et récepteurs éboueurs, sécrètent des médiateurs pro-inflammatoires, et les lymphocytes T ^12,14. Une population relativement pure de AMɸ (par exemple, supérieure à 80%) peut être facilement obtenu par un lavage du poumon à l'étude dans le laboratoire. Resident AMɸ récoltées à partir de immunitaires des animaux compétentes de fournir un phénotype représentant des macrophages qui encounter le vaccin à base de particules in vivo. Ici, nous décrivons les protocoles utilisés pour la récolte et la culture AMɸ de souris et d'examiner le phénotype d'activation des macrophages après le traitement avec des nanoparticules polyanhydride in vitro.

Protocol

1. La récolte macrophages alvéolaires (AMɸ) à partir de la souris en utilisant lavage du poumon

1. Porter un équipement de protection individuelle (EPI) comme un sarrau de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection.
2. Préparer complète AMɸ (cAMɸ) moyenne avant le début de la récolte. Ajouter 2,5 mL de pénicilline / streptomycine (pénicilline / streptomycine) solution, 250 pi de β-mercaptoéthanol (2-mercaptoéthanol), et 25 ml de la chaleur sérum inactivé de veau fœtal (FBS) à 222,25 mL de milieu de Dulbelcco Eagle modifié (DMEM). Filtre-stériliser moyennes cAMɸ l'aide d'un filtre à pores de 0,2 um top taille de la bouteille sous vide....

Discussion

Plates-formes de nanoparticules polyanhydride vaccins ont montré une efficacité lorsqu'il est administré par voie intranasale à des posologies à dose unique ^5. Mesure de l'activation des cellules phagocytaires populations résidentes dans les poumons induites par cette plate-forme d'administration des vaccins permettant l'évaluation de sa capacité potentielle à terme, de promouvoir des réponses immunitaires adaptatives.

Plus précisément, la récolte des macrophages a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Le numéro de catalogue	Commentaires
CAM médias
DMEM	Cellgro	15-013-CV
50 mM de 2-mercaptoéthanol	Sigma	M3148-25ML
Pénicilline / streptomycine 10000 ug / ml Solution	Cellgro	30-002-CI
Sérum fœtal bovin	Atlanta Biologicals	S11150
FACS tampon
Le chlorure de sodium	Fisher Scientific	S671-500
Phosphate de sodium	Fisher Scientific	MK7868500
Le chlorure de potassium	Fisher Scientific	P217500
Le phosphate de potassium	Fisher Scientific	P288-200
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	A7888
L'azoture de sodium	Sigma	S2002
Anticorps
Rat IgG	Sigma	I4341
Anti-Mme CD16/32	eBioscience	16-0161
Anti-Mme CMH II haplotype IA / IE, clone M5/114.15.2, conjugué à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC)	EBIOScience	11-5321
Anti-souris CD86, clone GL-1, conjugué à l'allophycocyanine (APC)-Cy7	Biolegend	105030
Anti-souris CD40, clone 1C10, conjugué à l'APC	eBioscience	17-0401
Anti-souris CD209, clone 5h10, conjugués à la biotine	eBioscience	13-2091
Anti-souris CD11b, clone M1/70, conjugué à Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0112
Anti-souris F4/80, clone BM8, conjugué à la phycoérythrine (PE)-Cy7	eBioscience	25-4801
PE-rouge Texas streptavidine conjuguée	BD Biosciences	551487
Autres fournitures et réactifs
L'éthanol	Fisher Scientific	A405-20	Utilisé comme 70% (v / v)
Comprimé CO 2	Linweld	16000060
Seringue de 1 ml	BD Biosciences	309659
Souverain 3 ½ "Père Tom Catcatheter	Kendall	703021
Prévention des risques biotechnologiques du Cabinet	NuAire	Série 22
Ciseaux de dissection	Pêcheur	138082
Forceps	Roboz	RS-8254
PBS 1X, sans calcium et de magnésium	Cellgro	21-040-CM
15 Tubes à centrifuger mL avec bouchon à vis	VWR International	21008-216
Tissue Culture Six-bien traités Plaques	Costar	3516
Portoirs pour tubes en plastique	Nalgene	5970
Grattoir à cellules 24 cm	PPT	99002
5 ml en polystyrène à fond rond Tube	Faucon	352008
Pipet-Aid XL	Drummond	4-000-105
10, 5, et 2 mL Pipettes	Pêcheur	13-675
200 et 10 ul micropipettes	Gilson Pipetman	F123601
200 et 10 embouts de pipette ul	Pêcheur	02-707
BD stabilisationFixateur	BD Biosciences	338036
Isoton II Diluant	Beckman-Coulter	8546719
Zap-oglobin II lytique réactif	Beckman-Coulter	7546138
Flacons Coulter polystyrène compteur	Beckman-Coulter	14310-684
Tubes à essai	BD Biosciences	352008
Équipement
Centrifugeuse réfrigérée	Labnet	50075040
Incubateur humidifié CO 2	Nuaire	Autoflow Modèle 8500
Cytomètre en flux FACSCanto	BD Biosciences	338960
Compteur de particules Coulter Z1	Beckman-Coulter	WS-Z1DUALPC
Équipement de traitement Sonicator liquide avec Microtip	Misonix	Modèle n ° S-4000