Murine वायुकोशीय मैक्रोफेज कटाई और मूल्यांकन सेलुलर Polyanhydride नैनोकणों से प्रेरित सक्रियकरण
Summary
इस के साथ साथ, हम murine वायुकोशीय मैक्रोफेज, जो सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के फेफड़ों में निवास कर रहे हैं, और सह संस्कृति के जवाब में polyanhydride नैनोकणों के साथ अपने सक्रियण की जांच की कटाई के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
Biodegradable नैनोकणों श्वसन संक्रामक रोगों के खिलाफ नए intranasal टीके के डिजाइन और कार्यान्वयन के लिए एक बहुमुखी मंच के रूप में उभरा है. विशेष रूप से, polyanhydride स्निग्ध sebacic एसिड (एसए), सुरभित (पी carboxyphenoxy) 1,6 – बीआईएस हेक्सेन (CPH), या amphiphilic (पी carboxyphenoxy) 1,8 – बीआईएस -3,6 dioxaoctane से बना नैनोकणों (CPTEG) अद्वितीय थोक और सतह कटाव कैनेटीक्स 1,2 प्रदर्शन और धीरे 3,4,5 vivo में कार्यात्मक biomolecules के (जैसे, प्रोटीन प्रतिजनों, immunoglobulins, आदि) जारी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ये भी अधिकारी आंतरिक सहायक गतिविधि नैनोकणों, उन्हें 6,7,8 एक वैक्सीन वितरण मंच के लिए एक उत्कृष्ट पसंद बना.
आदेश में intranasal mucosal टीकाकरण के बाद सहज रोगक्षमता की सक्रियण संचालन तंत्र को स्पष्ट करने के लिए, एक प्रतिजन पी की आणविक और सेलुलर प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करना होगाresenting (APCs) कोशिकाओं प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शुरुआत के लिए जिम्मेदार है. वृक्ष के समान कोशिकाओं प्रिंसिपल APCs वायुमार्ग आयोजन में पाया है, जबकि वायुकोशीय मैक्रोफेज (AMɸ) फेफड़ों पैरेन्काइमा 9,10,11 में प्रबल होना. AMɸ माइक्रोबियल रोगज़नक़ों और कक्ष 12,13 मलबे के फेफड़ों समाशोधन में अत्यधिक कुशल हैं. इसके अलावा, इस सेल प्रकार से draining लिम्फ नोड्स, जो एक अनुकूली प्रतिरक्षा 9 प्रतिक्रिया की दीक्षा में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है माइक्रोबियल प्रतिजनों के परिवहन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. AMɸ भी सहज पैटर्न मान्यता और मेहतर रिसेप्टर्स, छिपाना समर्थक भड़काऊ मध्यस्थों, और प्रधानमंत्री भोले टी कोशिकाओं 12,14 का ऊंचा स्तर व्यक्त करते हैं. AMɸ (उदाहरण के लिए, 80% से अधिक) के एक अपेक्षाकृत शुद्ध आबादी आसानी से प्रयोगशाला में अध्ययन के लिए फेफड़ों के पानी से धोना के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. निवास AMɸ प्रतिरक्षा सक्षम जानवरों से काटा मैक्रोफेज है कि encounte के एक प्रतिनिधि फेनोटाइप प्रदानr vivo में कण आधारित टीका. इस के साथ साथ, हम चूहों से फसल और संस्कृति AMɸ के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन है और इन विट्रो में polyanhydride नैनोकणों के साथ इलाज के बाद मैक्रोफेज की जांच सक्रियण फेनोटाइप.
Protocol
Discussion
Polyanhydride nanoparticle टीका प्लेटफार्मों प्रभावकारिता दिखाया है, जब एकल खुराक 5 regimens में intranasally प्रशासित. इस वैक्सीन वितरण मंच द्वारा प्रेरित फेफड़ों के में निवासी phagocytic सेल आबादी के सक्रियण मापने अपने संभावित क्ष…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के लिए वित्तीय समर्थन और डा. शॉन Rigby के लिए आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी फ्लो सुविधा से अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान (अनुदान नंबर W81XWH-09-1-+०,३८६ और W81XWH-10-1-+०,८०६) धन्यवाद करना चाहते हैं उसके विशेषज्ञ तकनीकी सहायता.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phycoerythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½” Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher | 138082 | |
| Forceps | Roboz | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR International | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalgene | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | TPP | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman-Coulter | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman-Coulter | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman-Coulter | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman-Coulter | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 |
References
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