マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する
Summary
ここで、我々は、肺に先天性免疫細胞を常駐し、無水物ナノ粒子との共培養に応答して活性化を検討しているマウスの肺胞マクロファージを採取するためのプロトコルについて説明します。
Abstract
生分解性ナノ粒子は、呼吸器感染症に対する新規経鼻ワクチンの設計と実装のための汎用プラットフォームとして浮上している。具体的には、無水物は、脂肪族セバシン酸（SA）、芳香族1,6 -ビス（p-カルボキシフェノキシ）ヘキサン（CPH）、または両親媒性1,8 -ビス（p-カルボキシフェノキシ）-3,6 -ジオキサオクタンから成るナノ粒子（CPTEG）はin vivoで 3,4,5 で一意のバルクと表面浸食速度論1,2を表示し、徐々に機能的な生体分子（例えば、タンパク質抗原、免疫グロブリンなど）を解放するために悪用される可能性があります。これらは、それらのワクチン·デリバリー·プラットフォーム6,7,8のための優れた選択肢となり、本質的なアジュバント活性を有する、ナノ粒子。
鼻腔粘膜のワクチン接種後に自然免疫の活性化を支配するメカニズムを解明するために、1つは、抗原Pの分子や細胞の応答を評価する必要があります免疫応答を開始するための責任憤り細胞（APC）。樹状細胞は肺胞マクロファージは（AMɸ）肺実質9,10,11で一世を風靡しながら、気道を行うに見られる主なAPCのです。 AMɸ微生物病原体や細胞破片12,13の肺をクリアに非常に効率的です。さらに、この細胞型は、適応免疫応答9の開始に重要な最初のステップである所属リンパ節への微生物抗原の輸送に重要な役割を果たしています。 AMɸまた、生得的なパターン認識とスカベンジャー受容体、分泌炎症誘発性メディエーター、及び主要なナイーブT細胞12,14の上昇を表現しています。 AMɸ（例えば、80％以上）の比較的純粋な人口は容易に実験室での研究のために肺洗浄を介して取得することができます。 AMɸ免疫有能な動物から採取した居住者はencounteれマクロファージの代表的な表現型を提供するin vivoでの rは粒子ベースのワクチン。ここで、我々は、マウスからの収穫と文化AMɸに使用されるプロトコルを記述し、in vitroでの無水物ナノ粒子を用いた治療後にマクロファージの活性化の表現型を調べます。
Protocol
1。肺洗浄を使用してマウスから肺胞マクロファージを（AMɸ）収穫このような実験着と使い捨て手袋、適切な眼の保護、適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。 収穫の開始前に完全なAMɸ（cAMɸ）培地を準備します。 Dulbelccoダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の222.25 mLのペニシリン/ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌）溶液に、β-メルカプトエタノール（2 – メ?…
Discussion
単回投与レジメン5で鼻腔内に投与した場合、無水物ナノ粒子ワクチンのプラットフォームでは有効性を示している。このワクチン·デリバリー·プラットフォームによって誘発される肺内に常駐貪食細胞集団の活性化を測定することにより、最終的に適応免疫応答を促進するために、その潜在的能力の評価を可能にします。
具体的には、肺胞洗浄液から肺胞マク?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、のためにアイオワ州立大学のフローサイトメトリー施設からの財政支援と博士ショーン·リグビーは、米国陸軍医学研究および資材コマンド（グラント番号W81XWH-09-1から0386までとW81XWH-10-1-0806）に感謝したいと思います彼の専門的なテクニカルサポートを提供しています。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phycoerythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½” Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher | 138082 | |
| Forceps | Roboz | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR International | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalgene | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | TPP | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman-Coulter | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman-Coulter | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman-Coulter | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman-Coulter | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 |
References
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Citer Cet Article
Chavez-Santoscoy, A. V., Huntimer, L. M., Ramer-Tait, A. E., Wannemuehler, M., Narasimhan, B. Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles. J. Vis. Exp. (64), e3883, doi:10.3791/3883 (2012).