Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화
Summary
여기, 우리는 폐에 타고난 면역 세포를 거주하고 polyanhydride의 nanoparticles와 공동으로 문화에 대한 응답으로 자신의 활성화를 검토하고 있습니다 murine 폐포 macrophages를 수확을위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
생분해성 nanoparticles는 호흡기 감염증에 대한 새로운 비강 백신의 설계 및 구현을위한 다목적 플랫폼으로 등장했습니다. 특히, polyanhydride는 지방족 sebacic 산성 (SA), 방향족 1,6 – 비스 (파라 – carboxyphenoxy) 헥산 (CPH) 또는 amphiphilic 1,8 – 비스 (파라 – carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane 구성되어 nanoparticles (CPTEG) 독특한 벌크 및 표면 부식 속도론 1,2을 표시하고 천천히 생체내 3,4,5의 기능 biomolecules (예, 단백질 항원, 면역 글로불린 등) 출시될 악용될 수 있습니다. 이러한 그들 백신 전달 플랫폼 6,7,8을위한 탁월한 선택하고, 또한 소유 내장 도움이되는 활동 nanoparticles.
비강 점막 접종에 따라 타고난 면역의 활성화를 지배하는 메커니즘을 명료하게하다하기 위해, 하나는 항원 P의 분자 및 세포 반응을 평가한다면역 반응을 시작 책임을 원망 세포 (APCs). 폐포 macrophages는 (AMɸ) 폐 실질 조직 9,10,11에 predominate 동안 돌기 세포는기도를 실시 발견 교장 APCs 있습니다. AMɸ 미생물 병원균과 세포 잔해 12,13의 폐를 청소에 매우 효율적입니다. 또한이 세포 유형은 적응 면역 반응 9 개시에 중요한 첫 걸음이다 배수 림프절에 미생물 항원의 수송에 중요한 역할을한다. AMɸ 또한 타고난 패턴 인식 및 청소 수용체, 분비 프로 염증 중재자, 및 주요 나이브 T 세포 12,14의 높은 수준을 표현. AMɸ (예,보다 큰 80 %)의 비교적 순수한 인구는 쉽게 연구실에서 공부를 위해 폐 세척을 통해 얻을 수있다. AMɸ 면역 능력이 동물로부터 수확 거주 encounte됩니다 macrophages의 대표적인 표현형를 제공합니다생체내의 R은 입자 기반의 백신. 여기, 우리는 생쥐에서 수확과 문화 AMɸ에 사용되는 프로토콜을 설명하고 체외에서 polyanhydride의 nanoparticles와 치료에 따라 macrophages의 활성화 표현형 검사합니다.
Protocol
1. 폐 세척을 사용하여 마우스에서 폐포 Macrophages을 (AMɸ) 수확 이러한 실험 복, 일회용 장갑, 적절한 눈 보호 등 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. 수확 개시 전에 전체 AMɸ (cAMɸ) 매체를 준비합니다. 페니실린 / 스트렙토 마이신 Dulbelcco의 수정일 독수리 중간 (DMEM)의 222.25 ML에 (펜 / strep) 솔루션, β-메르 캅 토 에탄올 250 μL (2 – 메르 캅 토 에탄올) 및 열 inactivated 태아 소 혈?…
Discussion
단일 선량 regimens 5 intranasally 실시하면 Polyanhydride의 nanoparticle 백신 플랫폼은 효능을 보여주었다. 이 백신 전달 플랫폼에 의해 유도된 폐의 주민 phagocytic 세포 인구의 활성화를 측정하는 것은 그것의 잠재적인 능력의 평가는 궁극적으로 적응 면역 반응을 촉진하도록 허용합니다.
특히, 폐 세척 유체에서 폐포 macrophages를 수확하고 nanoparticles의 다른 공법으로 그들을 치?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자를 위해 아이오와 주립 대학 유동세포계측법 시설에서 재정 지원과 박사 션 Rigby 위해 미군 의료 연구 및 Materiel 명령 (부여 번호 W81XWH-09-1-0386 및 W81XWH-10-1-0806)에 감사드립니다 그의 전문 기술 지원.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phycoerythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½” Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher | 138082 | |
| Forceps | Roboz | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR International | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalgene | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | TPP | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman-Coulter | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman-Coulter | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman-Coulter | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman-Coulter | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 |
References
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Citer Cet Article
Chavez-Santoscoy, A. V., Huntimer, L. M., Ramer-Tait, A. E., Wannemuehler, M., Narasimhan, B. Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles. J. Vis. Exp. (64), e3883, doi:10.3791/3883 (2012).