Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido
Summary
Aquí se describen los protocolos para la recogida de los macrófagos alveolares murinos, que residan las células inmunes en el pulmón, y el examen de su activación en respuesta a la co-cultivo con nanopartículas polianhídrido.
Abstract
Nanopartículas biodegradables se han convertido en una plataforma versátil para el diseño e implementación de nuevas vacunas intranasales contra enfermedades infecciosas respiratorias. Específicamente, polianhídrido nanopartículas compuesto del ácido alifático sebácico (SA), la aromático 1,6-bis (p-carboxifenoxi) hexano (LPA), o la anfifílico 1,8-bis (p-carboxifenoxi) -3,6-dioxaoctano (CPTEG) muestran granel único y cinética de la superficie de erosión 1,2 y puede ser explotado para liberar lentamente biomoléculas funcionales (por ejemplo, antígenos proteicos, inmunoglobulinas, etc) de vivo 3,4,5. Estas nanopartículas tienen también actividad adyuvante intrínseca, por lo que una excelente elección para una plataforma de administración de la vacuna 6,7,8.
Con el fin de dilucidar los mecanismos que regulan la activación de la inmunidad innata la mucosa nasal después de la vacunación, se debe evaluar las respuestas moleculares y celulares del antígeno pcélulas resentidos (APC), responsables de iniciar la respuesta inmune. Las células dendríticas son las CPA principales que se encuentran en la realización de las vías respiratorias, mientras que los macrófagos alveolares (AMɸ) predominan en el parénquima pulmonar 9,10,11. AMɸ son altamente eficientes en la limpieza de los pulmones de los microbios patógenos y los residuos celulares 12,13. Además, este tipo de células juega un papel importante en el transporte de antígenos microbianos a los ganglios linfáticos de drenaje, que es un primer paso importante en la iniciación de una respuesta inmune adaptativa 9. AMɸ también expresan niveles elevados de reconocimiento de patrones innatos y los receptores scavenger, los mediadores pro-inflamatorios secretan, y las células T vírgenes 12,14. Una población relativamente pura de AMɸ (por ejemplo, superior al 80%) se puede obtener fácilmente a través de lavado pulmonar para su estudio en el laboratorio. Residente AMɸ recogerá a partir de animales inmunes competentes faciliten un fenotipo representante de los macrófagos que encounter la vacuna basada en partículas in vivo. Aquí se describen los protocolos utilizados para la cosecha y la cultura AMɸ de ratones y examinar el fenotipo de la activación de los macrófagos después del tratamiento con nanopartículas polianhídrido in vitro.
Protocol
Discussion
Polianhidrido plataformas de la vacuna de nanopartículas han demostrado su eficacia cuando se administra por vía intranasal en los regímenes de dosis única 5. Medición de la activación de las poblaciones de células fagocíticas residentes en los pulmones inducidas por esta plataforma de administración de vacunas permite la evaluación de su capacidad potencial para promover en última instancia la respuesta inmune adaptativa.
En concreto, la cosecha macrófagos alveolares …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y Material de comandos (números de concesión W81XWH-09-1-0386 y W81XWH-10-1-0806) para el apoyo financiero y el Dr. Shawn Rigby del Fondo Estatal de Iowa Citometría de flujo para la Universidad su experto en asistencia técnica.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phycoerythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½” Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher | 138082 | |
| Forceps | Roboz | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR International | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalgene | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | TPP | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman-Coulter | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman-Coulter | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman-Coulter | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman-Coulter | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 |
References
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