شفط Micropipette من خلايا الركيزة المرفقة لتقدير تصلب الخليوي
Summary
نحن هنا وصف طريقة سريعة وبسيطة لقياس صلابة الخلية. المبدأ العام لهذا النهج هو لقياس تشوه الغشاء استجابة لضغوط واضحة المعالم من خلال تطبيق السلبية micropipette إلى سطح الخلية. هذا الأسلوب يوفر أداة قوية لدراسة خصائص النشاط الحيوي للخلايا الركيزة المرفقة.
Abstract
عدد متزايد من الدراسات تبين أن خصائص النشاط الحيوي لخلايا الفرد تلعب دورا هاما في الوظائف الخلوية متعددة، بما في ذلك انتشار الخلايا، والتمايز، والهجرة والتفاعلات الخلية الخلية. المعلمتين الرئيسية الميكانيكا الحيوية الخلوية هي قابلية تغيير الشكل الخلوية أو تصلب وقدرة الخلايا للتعاقد وتوليد القوة. نحن هنا وصف طريقة سريعة وبسيطة لتقدير صلابة الخلايا عن طريق قياس درجة تشوه الغشاء استجابة لضغوط سلبية تطبقها micropipette الزجاج إلى سطح الخلية، وهي تقنية تسمى شفط Micropipette أو Microaspiration.
يتم تنفيذ Microaspiration عن طريق سحب الزجاج الشعرية لإنشاء micropipette مع طرف صغيرة جدا (2-50 ميكرون قطر تبعا لحجم الخلية أو عينة الأنسجة)، وهذا مرتبط ثم إلى هوائي محول الضغط وتسببت في إغلاق محيط خلية تحت المجهر. عندماغيض من ماصة يمس خلية، وهي خطوة من الضغط السلبي يتم تطبيقها على ماصة من محول الضغط الهوائية توليد ضغط واضحة المعالم على غشاء الخلية. في استجابة للضغوط، ويستنشق الغشاء في تشوه الغشاء ماصة وتقدمية أو "غشاء الإسقاط" في يقاس ماصة بوصفها وظيفة من الزمن. المبدأ الأساسي لهذا النهج التجريبي هو أن درجة تشوه الغشاء استجابة لقوة ميكانيكية محددة هي وظيفة من تصلب الغشاء. وصلابة غشاء هو، وأبطأ معدل تشوه الغشاء وأقصر لا يمكن أن يؤديها في length.The طموح ثابت للدولة على خلايا معزولة تقنية، سواء في التعليق والركيزة المرفقة، العضيات كبيرة، والليبوزومات.
يتم تنفيذ تحليل الغشاء من خلال مقارنة التشوهات القصوى تتحقق في ظل ضغط معين للسكان مختلفة من الخلايا أو الظروف التجريبية. A "معامل صلابة" هو EStimated من التآمر على طول يستنشق من تشوه الغشاء بوصفها وظيفة من الضغوط التي مورست. وعلاوة على ذلك، يمكن للبيانات لمزيد من التحليل لتقدير معامل يونغ في الخلايا (E)، المعلمة الأكثر شيوعا لوصف صلابة المواد. من المهم أن نلاحظ أن ويمكن الاطلاع الأغشية البلازما من خلايا حقيقية النواة ونظام ثنائي مكون حيث underlied الغشاء طبقة ثنائية المادة الدهنية من الهيكل الخلوي غشاء شبه وأنه هو الذي يشكل الهيكل الخلوي السقالة الميكانيكية للغشاء ويسيطر على قابلية تغيير الشكل من المغلف الخلوية. هذا النهج، لذلك، يسمح تحقق خصائص النشاط الحيوي من الهيكل الخلوي الفرعي الغشاء.
Protocol
Discussion
Microaspiration يوفر طريقة بسيطة للغاية وقابلة للتكرار لتقدير صلابة الخلية / قابلية تغيير الشكل عن طريق تطبيق الضغط السلبي إلى غشاء الخلية وغشاء قياس قابلية تغيير الشكل استجابة لضغوط واضحة المعالم. وقد وضعت لأول مرة من قبل وميتشيسون سوان (1954) لوصف خصائص المرونة من قنفذ البح?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog/Model Number | Comments |
| Sutter pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | Axiovert 200M | The microscope should be preferably equipped with 3D/deconvolution capabilities. |
| Videocamera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Image Acquisition sotware | Zeiss | AxioVision | |
| Pneumatic Pressure Transducer | BioTek | DPM-1B | DPM1B Pneumatic Transducer Tester can now be found by FLUKE. |
| Pipette glass | Richland | Customized glass | Pipettes were customized with a 1.2 inner diameter and 1.6 outer diameter. |
| DiI Dye | Invitrogen | D282 | Dissolves well in DMSO |
References
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. I. Membrane stiffness and intracellular pressure. Biophys. J. 4, 115-135 (1964).
- Discher, D. E., Mohandas, N., Evans, E. A. Molecular maps of red cell deformation: hidden elasticity and in situ connectivity. Science. 266, 1032-1035 (1994).
- Schmid-Schönbein, G. W., Sung, K. L., Tözeren, H., Skalak, R., Chien, S. Passive mechanical properties of human leukocytes. Biophys. J. 36, 243-256 (1981).
- Guilak, F., Tedrow, J. R., Burgkart, R. Viscoelastic properties of the cell nucleus. Biochem. Biophys. Re.s Commun. 269, 781-786 (2000).
- Needham, D., Nunn, R. S. Elastic deformation and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol. Biophys. J. 58, 997-1009 (1990).
- Sato, M., Theret, D. P., Wheeler, L. T., Ohshima, N., Nerem, R. M. Application of the micropipette technique to the measurement of cultured porcine aortic endothelial cell viscoelastic properties. Journal of Biomechanical Engineering. 112, 263-268 (1990).
- Theret, D. P., Levesque, M. J., Sato, F., Nerem, R. M., Wheeler, L. T. The application of a homogeneous half-space model in the analysis of endothelial cell micropipette measurements. J. of Biomechanical Engineering. 110, 190-199 (1988).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. J. Biomech. 33, 15-22 (2000).
- Lim, C. T., Zhou, E. H., Quek, S. T. Mechanical models for living cells–a review. Journal of Biomechanics. 39, 195 (2006).
- Zhao, R., Wyss, K., Simmons, C. A. Comparison of analytical and inverse finite element approaches to estimate cell viscoelastic properties by micropipette aspiration. Journal of Biomechanics. 42, 2768 (2009).
- Chien, S., Sung, K. L., Skalak, R., Usami, S., Tozeren, A. Theoretical and experimental studies on viscoelastic properties of erythrocyte membrane. Biophys. J. 24, 463-487 (1978).
- Evans, E., Kuhan, B. Passive material behavior of granulocytes based on large deformation and recovery after deformation tests. Blood. 64, 1028-1035 (1984).
- Sato, M., Levesque, M. J., Nerem, R. M. Micropipette aspiration of cultured bovine aortic endothelial cells exposed to shear stress. Arteriosclerosis. 7, 276-286 (1987).
- Byfield, F., Aranda-Aspinoza, H., Romanenko, V. G., Rothblat, G. H., Levitan, I. Cholesterol depletion increases membrane stiffness of aortic endothelial cells. Biophys. J. 87, 3336-3343 (2004).
- Byfield, F. J., Hoffman, B. D., Romanenko, V. G., Fang, Y., Crocker, J. C., Levitan, I. Evidence for the role of cell stiffness in modulation of volume-regulated anion channels. Acta. Physiologica. 187, 285-294 (2006).
- Byfield, F. J., Reen, R. K., Shentu, T. -. P., Levitan, I., Gooch, K. J. Endothelial actin and cell stiffness is modulated by substrate stiffness in 2D and 3D. Journal of Biomechanics. 42, 1114 (2009).
- Evans, E., Needham, D. Physical properties of surfactant bilayer membranes: thermal transitions, elasticity, rigidity, cohesion and colloidal interactions. Journal of Physical Chemistry. 91, 4219-4228 (1987).
- Sun, M., Northup, N., Marga, F., Huber, T., Byfield, F. J., Levitan, I., Forgacs, G. The effect of cellular cholesterol on membrane-cytoskeleton adhesion. J. Cell. Sci. 120, 2223-2231 (2007).
- Shentu, T. P., Titushkin, I., Singh, D. K., Gooch, K. J., Subbaiah, P. V., Cho, M., Levitan, I. oxLDL-induced decrease in lipid order of membrane domains is inversely correlated with endothelial stiffness and network formation. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, 218-229 (2010).
- Norman, L. L., Oetama, R. J., Dembo, M., Byfield, F., Hammer, D. A., Levitan, I., Aranda-Espinoza, H. Modification of Cellular Cholesterol Content Affects Traction Force, Adhesion and Cell Spreading. Cell Mol. Bioeng. 3, 151-162 (2010).
- Mitchinson, J. M., Swann, M. M. The Mechanical Properties of the Cell Surface: I. The Cell Elastimeter. J. of Experimental Biology. 31, 443-460 (1954).
- Byfield, F. J., Tikku, S., Rothblat, G. H., Gooch, K. J., Levitan, I. OxLDL increases endothelial stiffness, force generation, and network formation. J. Lipid Res. 47, 715-723 (2006).
- Ohashi, T., Ishii, Y., Ishikawa, Y., Matsumoto, T., Sato, M. Experimental and numerical analyses of local mechanical properties measured by atomic force microscopy for sheared endothelial cells. Biomed. Mater. Eng. 12, 319-327 (2002).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophysical Journal. 93, 4453 (2007).
- Kowalsky, G. B., Byfield, F. J., Levitan, I. oxLDL facilitates flow-induced realignment of aortic endothelial cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 295, 332-340 (2008).
- Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. , (2011).
- Kole, T. P., Tseng, Y., Huang, L., Katz, J. L., Wirtz, D. Rho kinase regulates the intracellular micromechanical response of adherent cells to rho activation. Mol. Biol. Cell. 15, 3475-3484 (2004).
- Hall, A. Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton. Science. 279, 509-514 (1998).
- Okajima, T. Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In. Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Fabry, B., Maksym, G. N., Butler, J. P., Glogauer, M., Navajas, D., Fredberg, J. J. Scaling the microrheology of living cells. Physical Review Letters. 87, 148102 (2001).
- Park, C. Y., Tambe, D., Alencar, A. M., Trepat, X., Zhou, E. H., Millet, E., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Mapping the cytoskeletal prestress. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Shin, D., Athanasiou, K. Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties. J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).
- Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers. Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).
- Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers. Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).
