Cariotipo spettrale allo studio anomalie cromosomiche negli esseri umani e nei topi con malattia del rene policistico
Summary
Cariotipo spettrale (SKY) è una tecnica avanzata citogenetica per individuare aberrazioni genomiche e cromosomiche. Questa tecnica si avvale di sonde cromosomiche pittura, che permettono la classificazione di tutti i cromosomi. SKY può anche identificare aberrazioni cromosomiche complesse e difetti segregazione nei topi e nell'uomo con varie patologie, tra cui la malattia del rene policistico.
Abstract
Metodo convenzionale per identificare e classificare i singoli cromosomi dipende dal modello unico bande di ciascun cromosoma in una determinata specie in fase di analisi 1, 2. Questa tecnica classica banding, tuttavia, non è affidabile nell'identificare complesse aberrazioni cromosomiche come quelle associate con il cancro. Per superare i limiti della tecnica banding, cariotipo spettrale (SKY) viene introdotto per fornire molte informazioni affidabili sulle anomalie cromosomiche.
SKY è una fluorescenza multicolor ibridazione in situ (FISH), tecnica per rilevare cromosomi in metafase, con microscopio spettrale 3, 4. SKY ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per l'analisi citogenetica di una vasta gamma di anomalie cromosomiche associate con un gran numero di malattie genetiche e tumori maligni 5, 6. SKY implica l'uso di sonde di DNA multicolor marcato in fluorescenza preparati dal degenerato oligonucleprimers otide mediante PCR. Così, ogni cromosoma ha un colore univoco spettrale dopo in-situ ibridazione con sonde, che sono differenzialmente etichettati con una miscela di coloranti fluorescenti (Rodamina, Texas Red, Cy5, FITC e Cy5.5). Le sonde utilizzate per SKY contenere fino a 55 sonde cromosoma specifiche 7-10.
La procedura per SKY prevede diversi passaggi (Figura 1). SKY richiede la disponibilità di cellule con elevato indice mitotico da tessuto normale o malato o di sangue. I cromosomi di una cellula singola da o una cella isolate di fresco primaria o una linea cellulare sono diffuse su un vetrino. Questo spread cromosoma è etichettato con una diversa combinazione di coloranti fluorescenti specifici per ciascun cromosoma. Per il rilevamento sonda e acquisizione delle immagini, il sistema di imaging spettrale consiste di interferometro Sagnac e una telecamera CCD. Questo permette misurazione dello spettro di luce visibile emessa dal campione e di acquisire una immagine spettrale frocromosomi m individuali. HiSKY, il software utilizzato per analizzare i risultati delle immagini catturate, fornisce una facile identificazione di anomalie cromosomiche. Il risultato finale è uno metafase e una immagine classificazione cariotipo, in cui ciascuna coppia di cromosomi ha un colore distinto (Figura 2). Questo permette una facile identificazione delle identità e le traslocazioni cromosomiche. Per ulteriori informazioni, visitare il sito Applied Spectral Imaging ( http://www.spectral-imaging.com/ ).
SKY è stato recentemente utilizzato per l'identificazione di difetti segregazione dei cromosomi e le anomalie cromosomiche negli esseri umani e nei topi con malattia autosomica dominante del rene policistico (ADPKD), una malattia genetica caratterizzata da una disfunzione in cilia primaria 11-13. Utilizzando questa tecnica, abbiamo dimostrato la presenza di segregazione dei cromosomi anormali e difetti cromosomici in pazienti ADPKD e modelli di topo 14. Ulteriori analisi basate SKY non solo ci ha permesso di identificare il numero cromosomico e identità, ma anche per rilevare con precisione le aberrazioni cromosomiche molto complessi come le delezioni e le traslocazioni cromosomiche (Figura 2).
Protocol
Discussion
Cariotipo spettrale (SKY) è una tecnica utilizzata nello studio di citogenetica composizioni genomiche e cromosomiche. Questa tecnica si avvale di sonde cromosoma pittura, e il rilevamento di queste sonde sono stati acquisiti tramite un interferometro di Sagnac. Il processo di SKY completo dura di solito circa una settimana, e coinvolge diversi passaggi chiave (Figura 1). La SKY utilizza un protocollo standard, che è stato descritto da Padilla-Nash et al 3. Il protocollo è stato p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi e Blair Mell per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da premi dal NIH (DK080640) e The University of Translational Research Award stimolazione Toledo & Promedica al dottor Surya Nauli.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| DMEM | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penecillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Colcemid | Roche Diagnostics | 10 295 892 001 | 10 μg/ml |
| HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| SKY paint probe kit (Human) | Applied Spectral Imaging | SKY000028 | |
| SKY paint probe kit (Mouse) | Applied Spectral Imaging | SKY000030 | |
| Concentrated antibody detection kit | Applied Spectral Imaging | SKY000033 | |
| Trypsin | Thermo Scientific | SH30236.01 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| RNase A | Roche Diagnostics | 10 109 169 001 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
| MgCl2 | Fluka | 63069-500ML | |
| 37% Formaldehyde | Mallinckrodt Baker | 2106-02 | |
| 20X SSC | Promega | V4261 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | prepare just before use |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Microscope glass slides | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Rubber cement | Elmer’s (local retail store) | ||
| Hybridization/ humidifiedchamber/Tray | Simport | M920-2 | put wet paper towels at the bottom |
| Thermocycler | Eppendorf | Epgradient S | |
| Shaking platform/Orbital shaker | Bellco Biotechnology | ||
| Shaking/water bath | Precision Scientific | ||
| DAPI filter cube | Chroma Technology | ||
| SKY filter cube | Chroma Technology | ||
| SpectraCube | Applied Spectral Imaging | ||
| Inverted cell culture microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS100 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX70 | 60X oil |
References
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