Isotachophoresis (ITP) er en robust elektrokinetiske separasjon og preconcentration teknikk med applikasjoner som spenner fra toksin påvisning til prøveopparbeidelse. Vi gjennomgår de fysiske prinsippene for ITP og metodikk for å bruke denne teknikken til to spesifikke eksempel søknader: separasjon og deteksjon av små molekyler og rensing av nukleinsyrer fra cellekultur lysate.
Elektrokinetiske teknikker er et fast innslag i mikroskala søknader på grunn av sin unike evne til å utføre en rekke fluidic og elektroforetiske prosesser i enkle, kompakte systemer med ingen bevegelige deler. Isotachophoresis (ITP) er en enkel og meget robust elektrokinetiske teknikk som kan oppnå millioner ganger preconcentration 1,2 og effektiv separasjon og utvinning basert på ionisk mobilitet. 3 For eksempel har vi demonstrert bruken av ITP til separasjon og sensitiv påvisning av umerket ioniske molekyler (f.eks giftstoffer, DNA, rRNA, Mirna) med liten eller ingen prøveopparbeidelse 4-8 og til utvinning og rensing av nukleinsyrer fra komplekse matriser inkludert cellekultur, urin og blod. 9-12
ITP oppnår fokus og separasjon ved hjelp av en anvendt elektrisk felt og to buffere i en fluidic kanal system. For anioniske analytter, er den ledende elektrolytt (LE) buffer valgt sUCH at dets anioner har høyere effektiv elektroforetiske mobilitet enn anioner av etterfølgende elektrolytt (TE) buffer (Effektiv mobilitet beskriver den observerbare drift hastigheten til et ion og tar hensyn til ionisering tilstand ion, som beskrevet i detalj av Persat et al 13.). Etter etablering av et grensesnitt mellom TE og LE er et elektrisk felt anvendt slik at LE ioner bevege seg bort fra området okkupert av TE ioner. Smak ioner av mellomliggende effektiv mobilitet rase foran TE ioner, men kan ikke kjøre forbi LE ioner, og så fokuserer de på LE-TE-grensesnitt (heretter kalt "ITP interface"). Videre TE og LE form regionene henholdsvis lav og høy ledningsevne, som etablerer en bratt elektrisk felt gradient på ITP grensesnittet. Dette feltet gradient preconcentrates prøve arter som de fokuserer. Riktig valg av TE og LE resultater i fokus og rensing av målarter fra andre ikke-fokuserte arter og, til slutt, separasjon end segregering av prøven arter.
Vi her gjennomgå de fysiske prinsipper som ligger til grunn ITP og diskutere to standard driftsmoduser: "peak" og "Plateau" moduser. I topp-modus, forholdsvis tynn sample ioner fokusere sammen innenfor overlappende trange topper på ITP grensesnittet. I platå modus, mer rikelig utvalg ioner nå en steady-state konsentrasjon og segregere inn tilstøtende platå-lignende soner sortert etter deres effektiv mobilitet. Peak og platå moduser oppstå ut av de samme underliggende fysikken, men representerer forskjellige regimer differensiert etter den innledende analyttkonsentrasjon og / eller hvor mye tid avsatt til prøven akkumulasjon.
Vi først beskrive i detalj en modell topp modus eksperiment, og deretter demonstrere en topp modus analysen for utvinning av nukleinsyrer fra E. coli cellekultur. Vi konkluderer med å presentere et platå modus analysen, hvor vi bruker en ikke-fokus tracer (NFT) arter for å visualisere separasjon og perdanne kvantifisering av aminosyrer.
De ITP metodene som presenteres her muliggjøre rask, følsom, og robust deteksjon og håndtering av ioniske molekyler. Hovedutfordringen i bruk ITP er riktig valg av LE og TE buffere. I anioniske ITP, vi vanligvis velger klorid som den ledende anionet fordi det er en sterk syre med svært høy absolutt mobilitet og dermed har svært forutsigbare egenskaper. Derfor er buffer valg i anioniske ITP typisk redusert til å velge en riktig TE og counterion. For selektive fokus eksperimenter, er TE valg kritisk til utelukkelse av forurensende ioner. I applikasjoner der forurensninger ikke er til stede, fører lavere TE effektiv mobilitet til raskere å fokusere. Vi anbefaler å bruke følgende, relativt veloppdragen anioniske TE ioner: MES, mopper, HEPES og tricine. Valg av counterion påvirker både system pH og TE effektiv mobilitet. Vanlige counterions er tris (pKa 8,1) og bis-tris (pKa 6,4). For analyser som krever lavere eller høyere pH, anbefaler vi pyridine (pKa 5,25) ogethanolamine (pKa 9,5), henholdsvis. I tabell 1 og 2, for anioniske og kationiske ITP, henholdsvis oppsummere vi flere nyttige buffer eksempler. Vi tar HCl som den anioniske LE ion og natrium som det kationiske LE ion, og vi antar 100 mm ionisk styrke LE buffer.
Leseren vil merke at bufferen ionisk styrke i våre protokoller (og i tabell 1-2) er alltid større enn eller lik 10 mm. Mens i teorien fysikken i ITP gjelder på ionisk styrke lavere enn 10 mm, naturlige forurensninger (f.eks karbonsyre fra reaksjon mellom vann og atmosfærisk karbondioksid) i nærheten av en mM nivået ofte begrenser den praktiske bruken av lave ioniske styrke buffere.
Vi registrerer at signaltransduksjon mekanismen ikke er begrenset til de analysene som presenteres i denne protokollen. Som omtalt kort i del 5, i platå modus renset soner kan oppdages via endringer i lokal konduktivitet, UV absorbance, temperatur, eller brytningsindeksen. I vår egen gruppe, har vi utviklet en metode som benytter lysstoffrør carrier ampholytes for sensitiv påvisning og identifikasjon av ukjente analytter. 5. I peak-modus eksperimenter, kan spesifikke prober brukes til å merke fokuserte analytter. I ett eksempel, bruker vi molekylære beacons – oligonukleotid sonder som fluoresce ved hybridisering til målet rekkefølge – for å oppdage mål DNA eller RNA-molekyler med høy spesifisitet 11,18.
Mens ITP er relativt robust mot spredning forårsaket av press-drevet flyt og EOF, kan overdreven EOF føre til stagnasjon av ITP grensesnittet, hvor gjennomsnittlig EOF hastigheten blir lik den ITP hastigheten. 14 slike sterke EOF oppstår spesielt under forhold med høy pH og lav ionisk styrke. Av denne grunn anbefaler vi bruk av buffere med pH 8 eller lavere og med ionisk styrke på størrelsesorden 100 mm dersom praktisk. Vår erfaring er PVP denmest effektive belegg for EOF undertrykkelse i borsilikat chips. Men på grunn av dens sikting egenskaper, kan PVP ikke være hensiktsmessig for enkelte programmer, for eksempel fokusere genomisk DNA. I eksperimenter, observerer vi at tillegg av PVP kan sterkt redusere genomisk DNA absolutt mobilitet (til et punkt der det ikke fokus). I disse tilfellene en silanol belegg som Sigmacote i conjuction med en tensidet (f.eks Triton-X 100) kan også være effektive i å redusere EOF. Ti
TE anion (pKa -1) | ||||
Bufring counterion (pKa +1) | MES (6.10) | MOPS (7,20) | HEPES (7.50) | tricine (8,15) |
ethanolamine (9,50) | 21.41 | 20.40 | 17.38 | 22.85 |
tris (8,08) | 21.00 | 19.23 </ Td> | 15.84 | 17.56 |
bis-tris (6,40) | 18.22 | 10.41 | 7,30 | 5,23 |
pyridine (5,18) | 1,01 | 3,72 | 2,42 | 1,48 |
Tabell 1. Effektiv mobilitet magnitude (× 10 -9 m 2 / V / s) av justert ren analytt sone i anioniske ITP der LE er 100 mm HCl og 200 mm buffering counterion.
TE kasjon (pKa +1) | ||||
Bufring counterion (pKa -1) | ethanolamine (9,50) | tris (8,08) | bis-tris (6,40) | pyridine (5,18) |
MES (6.10) | 35.57 | 21.96 | 16.39 | 10.45 |
MOPS (7,20) | 35.47 | 20.92 | 9,76 | 3,93 |
HEPES (7.50) | 35.35 | 19.97 | 7,77 | 2,88 |
Tricine (8,15) | 34.77 | 16.72 | 4,50 | 1,44 |
Tabell 2. Effektiv mobilitet magnitude (× 10 -9 m 2 / V / s) av justert ren analytt sone i kationiske ITP der LE er 100 mm natrium og 200 mm buffering counterion.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke for støtte fra DARPA sponset Micro / Nano lufthåndtering Fundamentals Focus (MF3) Center under kontrakt nummer N66001-10-1-4003, og fra DARPA stipend N660001-09-C-2082.
REAGENTS | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Distilled water | GIBCO | 10977 | RNase/DNase free |
Clorox Ultra | Clorox | 02489CT | |
sodium hydroxide (NaOH) | Mallinckrodt | 7708 | |
hydrochloric acid (HCl) | EMD Chemicals | HX0603-4 | |
Trizma base (tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
polyvinylpyrrolidone (PVP) | Polysciences Inc. | 06067 | MW 1,000,000 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
Alexa Fluor 488 carboxylic acid | Invitrogen | A20000 | |
tricine | Sigma-Aldrich | T-9784 | |
bis-tris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
EDTA | GIBCO | AM9260G | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
SYBR Green II | Invitrogen | S7564 | |
ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000 | |
Rhodamine 6G | Acros Organics (Geel, Belgium) | CAS 989-38-8 | |
L-Amino Acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4389986 | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | ||
EQUIPMENT | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate microfluidic chip | Caliper Life Sciences Inc. | NS12A | Supplied with or without plastic caddy |
Vacuum pump | Gast | DOA-P104-AA | |
Sourcemeter | Keithley | 2410 | Constant current and constant voltage operation modes |
Inverted epifluorescent microscope | Olympus | IX70 | Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination |
Filter cube | Omega | XF115-2 | Excitation/emission: blue/green |
Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022363204 | 1.5 mL capacity |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C |
Table 3. Specific reagents and equipment.