Isotakofores (ITP) är en robust elektrokinetisk separation och förkoncentrering teknik med tillämpningar som sträcker sig från toxin upptäckt att provberedning. Vi går igenom de fysikaliska principerna för ITP och metoder att tillämpa denna teknik på två specifika exempel applikationer: separation och detektion av små molekyler och rening av nukleinsyror från cellodling lysat.
Elektrokinetiska tekniker är en stapelvara i mikroskala tillämpningar på grund av sin unika förmåga att utföra en rad olika fluida och elektrofores processer i enkla, kompakta system med inga rörliga delar. Isotakofores (ITP) är en enkel och robust elektrokinetiska teknik som kan åstadkomma miljon gånger förkoncentrering 1,2 och effektiv separation och utvinning baserat på jonisk mobilitet. 3 Till exempel, har vi visat att applicering av ITP till separation och känslig detektering av omärkt joniska molekyler (t.ex. toxiner, DNA, rRNA, Mirna) med liten eller ingen provberedning 4-8 och till utvinning och rening av nukleinsyror från komplexa matriser, inklusive cellodling, urin och blod. 9-12
ITP uppnår fokusering och separation med användning av ett pålagt elektriskt fält och två buffertar inom en fluidisk kanalsystem. För anjoniska analyter, är den ledande elektrolyt (LE) buffert vald sn sådan att dess anjoner har högre effektiv elektroforetisk mobilitet än de anjoner av den bakre elektrolyt (TE)-buffert (effektiv rörlighet beskriver den observerbara drifthastighet av en jon och tar hänsyn till jonisering tillstånd jon, såsom beskrivs i detalj av Persat et al . 13). Efter upprättande av ett gränssnitt mellan TE och LE är ett elektriskt fält appliceras så att LE joner rör sig bort från området ockuperat av TE joner. Exempel på joner av intermediär effektiv rörlighet race före TE joner men kan inte köra LE joner, och så att de fokuserar på LE-TE gränssnitt (nedan kallad "ITP-gränssnittet"). Ytterligare, TE och LE regioner bilda av respektive låg och hög ledningsförmåga, som skapar en brant elektriskt fält lutning på ITP-gränssnittet. Detta fält gradient preconcentrates provbeståndsdelar som de fokusera. Korrekt val av TE-och LE resulterar i att fokusera och rening av målart från andra icke-fokuserade arter och slutligen separation ettd segregation av prov arter.
Vi granskar här fysiska principerna för ITP och diskutera två standard driftsformer "topp" och "platå" lägen. I topp läge relativt utspädd provjonerna fokusera tillsammans inom överlappande smala toppar på ITP-gränssnittet. I platå läge rikligare provjonerna nå en steady-state koncentration och segregerar i angränsande platåliknande zoner sorteras efter effektiv rörlighet. Peak och platå lägen uppstår ur samma underliggande fysiken, men representerar olika regimer uppdelade efter den initiala analytkoncentrationen och / eller den tid som avsatts för prov ackumulering.
Vi beskriver först i detalj en modell experiment topp läge och sedan visar en topp-läge analys för utvinning av nukleinsyror från E. coli cellkultur. Vi avslutar med att presentera en analys platå läge, där vi använder en icke-fokus spårämne (NFT) arter att visualisera separationen och perbilda kvantifiering av aminosyror.
De ITP metoderna presenteras här möjliggör snabb, känslig och robust upptäckt och hantering av joniska molekyler. Den största utmaningen i att använda ITP är korrekt val av LE och TE buffertar. I anjoniska ITP, väljer vi vanligtvis klorid som den ledande anjon eftersom det är en stark syra med mycket hög absolut rörlighet och därmed har mycket förutsägbara egenskaper. Därför buffert val anjoniska ITP normalt reduceras till att välja en lämplig TE och motjon. Selektiva fokus experiment är TE valet avgörande för uteslutande av kontaminerande joner. I tillämpningar där föroreningar inte finns leder lägre TE effektivt rörlighet snabbare fokusering. Vi rekommenderar att du använder följande relativt väl uppförde anjoniska TE joner: MES, MOPS, HEPES, tricin. Val av motjonen påverkar både pH-värde och TE effektiv rörlighet. Vanliga motjoner är tris (pKa 8,1) och bis-tris-(pKa 6,4). För analyser som kräver lägre eller högre pH, rekommenderar vi pyridin (pKa 5,25) ochetanolamin (pKa 9,5), respektive. I Tabellerna 1 och 2, för anjoniska och katjoniska ITP respektive sammanfattar vi flera användbara buffert exempel. Vi tar HCl som det anjoniska LE jon och natrium som katjoniska LE jon, och vi antar 100 mM jonstyrka av LE bufferten.
Läsaren kommer att notera att styrka buffert joniska i våra protokoll (och i tabellerna 1-2) alltid är större än eller lika med 10 mm. Även i teorin fysik ITP gäller vid jonstyrka lägre än 10 mM, naturliga föroreningar (t.ex. kolsyra från reaktionen mellan vatten och koldioxid i atmosfären) i närheten av 1 mM nivån begränsar ofta den praktiska användningen av låg jonstyrka buffertar.
Vi noterar att signaltransduktion mekanismen inte är begränsad till de analyser som presenteras i detta protokoll. Som diskuterats kortfattat i del 5, i Plateau mode renade områden kan upptäckas genom förändringar i lokal ledningsförmåga, UV absorbance, temperatur, eller brytningsindex. I vår egen grupp, har vi utvecklat en metod som utnyttjar fluorescerande bäraramfolyter för känslig detektion och identifiering av okända analyter. 5 I topp läge experiment kan specifika prober användas för att märka fokuserade analyter. I ett exempel använder vi molekylär fyrar – oligonukleotidsonder som fluorescerar vid hybridisering till sitt mål sekvens – att upptäcka mål-DNA eller RNA-molekyler med hög specificitet 11,18.
Även ITP är relativt robust för spridning orsakad av tryck-driven flöde och EOF, kan överdriven EOF leda till stagnation i ITP gränssnitt där den genomsnittliga EOF hastigheten blir lika med ITP hastigheten 14. Så stark EOF förekommer, särskilt under förhållanden av högt pH och låg jonstyrka. Av denna anledning rekommenderar vi användning av buffertar med pH 8 eller lägre och med jonstyrka i storleksordningen 100 mm om lämpligt. Enligt vår erfarenhet är PVP imest effektiva beläggning för EOF undertryckande i borosilikatglas marker. Men på grund av dess siktning egenskaper kan PVP inte lämpligt för vissa applikationer, såsom fokus genomisk DNA. I experiment observerar vi att tillsats av PVP kraftigt kan minska DNA absoluta rörlighet (till den punkt där det inte fokus). I dessa fall en silanol beläggning såsom Sigmacote i samverkan med en tensid (t.ex. Triton-X 100) kan också vara effektiv i att reducera EOF. 10
TE anjon (pKa -1) | ||||
Buffring motjonen (pKa +1) | MES (6,10) | MOPS (7,20) | HEPES (7,50) | Tricin (8,15) |
etanolamin (9,50) | 21,41 | 20,40 | 17,38 | 22,85 |
tris (8,08) | 21,00 | 19,23 </ Td> | 15,84 | 17,56 |
Bis-Tris (6,40) | 18,22 | 10,41 | 7,30 | 5,23 |
pyridin (5,18) | 1,01 | 3,72 | 2,42 | 1,48 |
Tabell 1. Effektiv rörlighet magnitud (x 10 -9 m 2 / V / s) av justerat rent analyt zon i anjoniska ITP där LE är 100 mM HCl och 200 mM buffring motjon.
TE ning (pKa +1) | ||||
Buffring motjonen (pKa -1) | etanolamin (9,50) | tris (8,08) | Bis-Tris (6,40) | pyridin (5,18) |
MES (6,10) | 35,57 | 21,96 | 16,39 | 10,45 |
MOPS (7,20) | 35,47 | 20,92 | 9,76 | 3,93 |
HEPES (7,50) | 35,35 | 19,97 | 7,77 | 2,88 |
Tricin (8,15) | 34,77 | 16,72 | 4,50 | 1,44 |
Tabell 2. Effektiv rörlighet magnitud (x 10 -9 m 2 / V / s) av justerat rent analyt zon katjoniska ITP där LE är 100 mM natrium och 200 mM buffring motjon.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner tacksamt medel från DARPA sponsrade Micro / Nano Fluidics Fundamentals Focus (MF3) Center under avtalsnummer N66001-10-1-4003, och från DARPA bidrag N660001-09-C-2082.
REAGENTS | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Distilled water | GIBCO | 10977 | RNase/DNase free |
Clorox Ultra | Clorox | 02489CT | |
sodium hydroxide (NaOH) | Mallinckrodt | 7708 | |
hydrochloric acid (HCl) | EMD Chemicals | HX0603-4 | |
Trizma base (tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
polyvinylpyrrolidone (PVP) | Polysciences Inc. | 06067 | MW 1,000,000 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
Alexa Fluor 488 carboxylic acid | Invitrogen | A20000 | |
tricine | Sigma-Aldrich | T-9784 | |
bis-tris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
EDTA | GIBCO | AM9260G | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
SYBR Green II | Invitrogen | S7564 | |
ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000 | |
Rhodamine 6G | Acros Organics (Geel, Belgium) | CAS 989-38-8 | |
L-Amino Acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4389986 | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | ||
EQUIPMENT | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate microfluidic chip | Caliper Life Sciences Inc. | NS12A | Supplied with or without plastic caddy |
Vacuum pump | Gast | DOA-P104-AA | |
Sourcemeter | Keithley | 2410 | Constant current and constant voltage operation modes |
Inverted epifluorescent microscope | Olympus | IX70 | Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination |
Filter cube | Omega | XF115-2 | Excitation/emission: blue/green |
Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022363204 | 1.5 mL capacity |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C |
Table 3. Specific reagents and equipment.