Isolamento e analisi del genoma di virioni singole utilizzando "Genomica singolo virus '
Summary
Genomica singolo virus (SVG) è un metodo per isolare e amplificare il genoma di singoli virons. Sospensioni virali di un assemblaggio misto sono ordinati mediante citometria a flusso su un vetrino da microscopio con pozzi discrete contenenti agarosio, catturando così il virione e la riduzione del genoma taglio durante la lavorazione a valle. Intero genoma amplificazione viene ottenuta utilizzando multipla di amplificazione dello spostamento (MDA) risultante in materiale genomico che è adatto per il sequenziamento.
Abstract
Tutta l'amplificazione e sequenziamento del genoma delle cellule microbiche singole consente caratterizzazione genomica, senza la necessità di coltivazione 1-3. I virus, che sono onnipresenti e le più numerose entità sul nostro pianeta 4 e importante in tutti gli ambienti 5, devono ancora essere rivelati tramite approcci simili. Qui si descrive un metodo per isolare e caratterizzare il genoma di singoli virioni chiamati "Genomica singolo virus" (SVG). SVG utilizza citometria a flusso per isolare singoli virus e amplificazione del genoma intero di ottenere un'elevata molecolare DNA genomico peso (gDNA) che può essere utilizzato nelle successive reazioni di sequenziamento.
Protocol
Discussion
Un certo numero di fattori importanti devono essere prese in considerazione nell'applicazione di approcci SVG. Genotipizzazione, come è stato eseguito durante il proof-of-concept esperimento 13, non è un'opzione valida per gli isolati ambientali o sconosciute come primer conservati non sono disponibili in tutti i gruppi virali. Inoltre, sfondo sintesi del DNA o amplificazione aspecifica è comunemente riportati durante l'amplificazione mediante la reazione di MDA 14. Amplificazione no…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Ken Nealson per la sua intuizione e consulenza durante tutto il processo di preparazione del manoscritto.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
References
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
