La génomique des virus simples (SVG) est une méthode pour isoler et d'amplifier le génome de virions isolés. Suspensions virales d'un assemblage mixte sont triées par cytométrie de flux sur une lame de microscope, avec des puits discrètes contenant l'agarose, capturant ainsi le virion, et la réduction de cisaillement du génome au cours du traitement en aval. Amplification du génome entier est obtenue en utilisant une amplification par déplacement multiple (MDA) résultant en matériel génomique qui est approprié pour le séquençage.
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Article de méthode
L'isolement et l'analyse du génome des virions unique en utilisant la génomique du virus unique »
Dans cet article
Résumé
Résumé
Amplification du génome entier et le séquençage de cellules microbiennes simples permet une caractérisation génomique sans le besoin de la culture 1-3. Les virus, qui sont omniprésentes et les plus nombreuses entités de notre planète et 4 importante dans tous les environnements, 5 n'ont pas encore été révélé par des approches similaires. Nous décrivons ici une méthode pour isoler et caractériser les génomes des virions single intitulé «Génomique de virus unique» (SVG). SVG utilise la cytométrie en flux pour isoler les virus individuels et amplification du génome entier pour obtenir un ADN génomique de haut poids moléculaire (ADNg) qui peut être utilisé dans des réactions de séquençage suivantes.
Protocole
1. Préparation des suspensions virales
Avant d'isolement des virions par l'intermédiaire de simples cytométrie de flux, préparer des suspensions virales non fixées.
- Isoler des particules virales en utilisant des protocoles déjà établis en s'assurant suspension virale finale est contenue dans 0,1 um-filtré TE (Tris-EDTA, pH 8). Nous vous recommandons d'utiliser la filtration à flux tangentiel (TFF) s'approche 6 bien que d'autres méthodes ont été développées qui utilisent la floculation chimique 7.
- Énumérer des particules virales en utilisant des protocoles établis, par ....
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Discussion
Un certain nombre de facteurs importants doivent être pris en considération lors de l'application d'approches SVG. Génotypage, comme cela a été effectué au cours de la preuve de concept de l'expérience 13, n'est pas une option valable pour les isolats environnementaux ou inconnus comme amorces conservées ne sont pas disponibles dans tous les groupes virales. Aussi, fond synthèse de l'ADN ou de l'amplification non spécifique est fréquemment rapportées lors de l'amplification en util.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous tenons à remercier Ken Nealson pour sa perspicacité et conseils tout au long du processus de préparation du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tampon TE 1X | Invitrogen | 12090-015 | |
| Phénol saturé au tampon | Invitrogen | 15513-039 | |
| Kit GenomiPhi HY | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| Agarose LMP | Invitrogen | 16520100 | |
| Lame de microscope en PTFE | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 puits, diamètre 4 mm |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10 000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
Références
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10,....
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Réimpressions et autorisations
