Identification et isolement des cellules ne se divisant lentement dans le glioblastome humain Utilisation carboxy fluorescéine succinimidyl ester (CFSE)
Summary
Ce protocole vidéo montre l'application de la teinture fluorescente carboxyfluorescéine succinimidylester (CFSE) pour l'identification et la séparation des différentes sous-populations de cellules de glioblastome humain basé sur la fréquence de la division cellulaire.
Abstract
Hétérogénéité tumorale représente une caractéristique fondamentale soutenant la robustesse de la tumeur et présente un obstacle majeur au développement de stratégies thérapeutiques 1. Pour surmonter le problème de l'hétérogénéité tumorale, il est essentiel de développer des tests et des outils permettant phénotypique, (épi) l'identification génétique et fonctionnelle et la caractérisation des sous-populations tumorales qui conduisent pathologies spécifiques aux maladies et représentent des cibles cliniquement pertinentes. Il est maintenant bien établi que les tumeurs présentent distinct sous-fractions de cellules avec des fréquences différentes de la division cellulaire, et que les critères fonctionnels d'être lent vélo est positivement associée à la capacité de formation de tumeurs dans plusieurs cancers, notamment ceux du cerveau, du sein, de la peau et pancréas et leucémie 2-8. Le colorant fluorescent carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) a été utilisée pour suivre la fréquence de division des cellules in vitro et de vivo dans le sang tumors et des tumeurs solides tels que le glioblastome 2,7,8. La cellule-perméant non fluorescent pro-drogue de CFSE est converti par les estérases intracellulaires en un composé fluorescent, qui est retenu à l'intérieur des cellules par liaison covalente à des protéines par réaction de son radical succinimidyle avec des groupes amine intracellulaires pour former des liaisons amide stables 9. Le colorant fluorescent est également réparti entre les cellules filles lors des divisions, conduisant à la réduction de moitié de l'intensité de fluorescence avec chaque division cellulaire. Cela permet le suivi de la fréquence du cycle cellulaire jusqu'à huit à dix tours de la division 10. Capacité de rétention CFSE a été utilisé avec des cellules tumorales du cerveau pour identifier et isoler une sous-population vélo lente (top 5% colorant retenue cellules) a démontré d'être enrichie en activité des cellules souches du cancer 2.
Ce protocole décrit la technique de coloration des cellules avec CFSE et l'isolement des populations individuelles au sein d'une culture de l'homme glioblastome (GBM) dérivés de cellules possédant des taux de division différents en utilisant 2 cytométrie en flux. La technique a permis d'identifier et d'isoler une tumeur au cerveau lent vélo population de cellules en raison de leur capacité à retenir l'étiquetage CFSE.
Protocol
Discussion
Un nombre croissant d'études ont démontré l'importance d'une lente séparation sous-compartiment des cellules dans le cancer qui contribuent à la formation de tumeurs et 2-8 la résistance au traitement. Par conséquent, il est essentiel de décrire et de standardiser les méthodes expérimentales permettant l'étude de cette sous-population spécifique de cellules ou plus généralement de comparer des sous-populations avec des taux de croissance différents. Utilisation CFSE pour identif…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Centre de la Floride pour la recherche tumeurs cérébrales, l'Preston A. Wells Jr. centre de thérapie tumeur au cerveau et le National Institutes of Health (1R21CA141020-01).
Materials
| Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Fluorescent Cell Division Tracking Dye | Molecular Probes, Invitrogen | C34554 |
References
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
