Identification et isolement des cellules ne se divisant lentement dans le glioblastome humain Utilisation carboxy fluorescéine succinimidyl ester (CFSE)

Résumé

Ce protocole vidéo montre l'application de la teinture fluorescente carboxyfluorescéine succinimidylester (CFSE) pour l'identification et la séparation des différentes sous-populations de cellules de glioblastome humain basé sur la fréquence de la division cellulaire.

Résumé

Hétérogénéité tumorale représente une caractéristique fondamentale soutenant la robustesse de la tumeur et présente un obstacle majeur au développement de stratégies thérapeutiques ^1. Pour surmonter le problème de l'hétérogénéité tumorale, il est essentiel de développer des tests et des outils permettant phénotypique, (épi) l'identification génétique et fonctionnelle et la caractérisation des sous-populations tumorales qui conduisent pathologies spécifiques aux maladies et représentent des cibles cliniquement pertinentes. Il est maintenant bien établi que les tumeurs présentent distinct sous-fractions de cellules avec des fréquences différentes de la division cellulaire, et que les critères fonctionnels d'être lent vélo est positivement associée à la capacité de formation de tumeurs dans plusieurs cancers, notamment ceux du cerveau, du sein, de la peau et pancréas et leucémie ^2-8. Le colorant fluorescent carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) a été utilisée pour suivre la fréquence de division des cellules in vitro et in vivo dans le sang tumors et des tumeurs solides tels que le glioblastome ^2,7,8. La cellule-perméant non fluorescent pro-drogue de CFSE est converti par les estérases intracellulaires en un composé fluorescent, qui est retenu à l'intérieur des cellules par liaison covalente à des protéines par réaction de son radical succinimidyle avec des groupes amine intracellulaires pour former des liaisons amide stables ^9. Le colorant fluorescent est également réparti entre les cellules filles lors des divisions, conduisant à la réduction de moitié de l'intensité de fluorescence avec chaque division cellulaire. Cela permet le suivi de la fréquence du cycle cellulaire jusqu'à huit à dix tours de la division ^10. Capacité de rétention CFSE a été utilisé avec des cellules tumorales du cerveau pour identifier et isoler une sous-population vélo lente (top 5% colorant retenue cellules) a démontré d'être enrichie en activité des cellules souches du cancer ^2.

Ce protocole décrit la technique de coloration des cellules avec CFSE et l'isolement des populations individuelles au sein d'une culture de l'homme glioblastome (GBM) dérivés de cellules possédant des taux de division différents en utilisant ² cytométrie en flux. La technique a permis d'identifier et d'isoler une tumeur au cerveau lent vélo population de cellules en raison de leur capacité à retenir l'étiquetage CFSE.

Protocole

1. Préparation de la suspension de cellules de glioblastome unique

1. Gliomasphere culture est établie et maintenue en utilisant le test de neurosphères (NSA) comme décrit précédemment ^2,11,12.
2. Au moment approprié pour les passages gliomaspheres, le milieu contenant les sphères est enlevé, placé dans une taille stérile tube approprié culture de tissus, et centrifugé à 800 tours par minute (110 g) pendant 5 min à température ambiante.
3. Le surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension de sphères dans 1 ml de 0,05% de trypsine-EDTA et incubées à 37 ° C dans un bain d'eau pendant 3-5 min.
4. Un volume égal d&#....

Discussion

Un nombre croissant d'études ont démontré l'importance d'une lente séparation sous-compartiment des cellules dans le cancer qui contribuent à la formation de tumeurs et ^2-8 la résistance au traitement. Par conséquent, il est essentiel de décrire et de standardiser les méthodes expérimentales permettant l'étude de cette sous-population spécifique de cellules ou plus généralement de comparer des sous-populations avec des taux de croissance différents. Utilisation CFSE pour identifier et isoler d.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Type	Entreprise	Numéro de catalogue
NeuroCult NSC milieu de base (Human)	Moyen	Technologies des cellules souches	05750
NeuroCult NSC suppléments prolifération (Human)	Supplément de milieu	Technologies des cellules souches	05753
0,05% de trypsine-EDTA	Réactif	Gibco	25300-062
Inhibiteur de la trypsine du soja	Réactif	Sigma	T6522
Pénicilline / Streptomycine	Réactif	Gibco	15140-122
T25 flacon	Culture de conservation	Nalge Nunc internationale	136196
T80 flacon	Culture de conservation	Nalge Nunc internationale	178905
Tubes de 15 ml	Culture de conservation	BD Falcon	352096
Tubes de 50 ml	Culture de conservation	BD Falcon	352070
FEM	Facteur de croissance	R & D	2028-EG
CFSE CellTrace cellulaire Kit prolifération	Division cellulaire fluorescent Suivi Dye	Molecular Probes, Invitrogen	C34554