Identifiering och isolering av långsamt delande celler i humant glioblastom Använda karboxifluorescein succinimidylester (CFSE)
Summary
Denna video protokoll demonstrerar tillämpningen av det fluorescerande färgämnet karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) för identifiering och separering av olika delpopulationer av celler i människans glioblastom baserade på frekvensen av celldelning.
Abstract
Tumör heterogenitet är en grundläggande funktion som stöder tumör robusthet och presenterar en central hinder för utvecklingen av terapeutiska strategier 1. För att övervinna problemet med tumören heterogenitet, är det viktigt att utveckla analyser och verktyg som gör det möjligt fenotypisk (EPI) genetisk och funktionell identifiering och karakterisering av tumör subpopulationer som driver specifika sjukdomar sjukdomar och representerar kliniskt relevanta mål. Det är nu väl fastställt att tumörer uppvisar distinkta sub-fraktioner av celler med olika frekvenser av celldelning, och att de funktionella kriterierna för att vara långsam cykling positivt associerad med tumörbildning förmåga i flera cancerformer inklusive de av hjärnan, bröst, hud och pankreas samt leukemi 2-8. Det fluorescerande färgämnet karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) har använts för att spåra frekvensen delning av celler in vitro och in vivo i blodburen tumors och solida tumörer, såsom glioblastom 2,7,8. Cellen-genomträngande icke-fluorescerande pro-drug CFSE omvandlas genom intracellulära esteraser till en fluorescerande förening, som kvarhålles inuti celler genom kovalent bindning till proteiner genom reaktion av dess succinimidyl grupp med intracellulära amingrupper för att bilda stabila amidbindningar 9. Den fluorescerande färgämne är jämnt fördelad mellan dotterceller vid divisioner, vilket leder till en halvering av fluorescensintensiteten med varje celldelning. Detta möjliggör spårning av cellcykeln frekvens upp till 8-10 omgångar division 10. CFSE retentionskapacitet användes med celler hjärntumör att identifiera och isolera en långsam cykling underpopulation (topp 5% färgämne kvarhållande celler) visade att anrikas i cancer stamceller aktivitet 2.
Detta protokoll beskriver tekniken för färgning celler med CFSE och isolering av enskilda populationer inom en kultur av humant glioblastoma (GBM)-härledda celler som har olika division priser med flödescytometri 2. Tekniken har tjänat till att identifiera och isolera en hjärntumör långsam cykling population av celler på grund av deras förmåga att behålla CFSE märkning.
Protocol
Discussion
Ett ökande antal studier har visat hur viktigt det är en långsamt dela underavdelning av celler i cancer som bidrar till tumörbildning och behandling motstånd 2-8. Därför är det viktigt att beskriva och standardisera experimentella metoder som gör det möjligt att studera denna specifika subpopulation av celler eller mer allmänt att jämföra subpopulationer med olika tillväxttakt. Använda CFSE att identifiera och isolera undergrupper fraktioner av celler baserat på deras hastighet av celldelning…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Florida Centrum för hjärntumör Research, Preston A. Wells Jr Centrum för hjärntumör Terapi och National Institutes of Health (1R21CA141020-01).
Materials
| Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Fluorescent Cell Division Tracking Dye | Molecular Probes, Invitrogen | C34554 |
References
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
