Imagem de bioluminescência de NADPH oxidase em diferentes modelos animais

Summary

NADPH oxidase é a principal fonte de espécies reactivas de oxigénio (ROS) em fagócitos. Por causa da natureza efêmera de ROS, é difícil de medir e monitorar os níveis de ROS em animais vivos. Um método minimamente invasivo para quantificação de série de ROS em ratos vivos é descrito.

Abstract

NADPH oxidase é uma enzima importante que medeia a defesa do hospedeiro antibacteriana e antifúngica. Em adição ao seu papel na defesa do hospedeiro antimicrobiana, NADPH oxidase tem funções críticas de sinalização que modulam a resposta inflamatória ^1. Assim, o desenvolvimento de um método para medir, em "tempo real", a cinética da NADPH-oxidase geração de ROS derivado deve ser uma ferramenta de investigação valiosa para compreender os mecanismos de defesa do hospedeiro em causa, inflamação e lesão.

A doença granulomatosa crônica (CGD) é uma desordem hereditária do NADPH oxidase caracterizada por infecções graves e inflamação excessiva. A activação da NADPH oxidase de fagócitos requer translocação das suas subunidades citosólicas ^(phox p47, p67 ^phox, e p40 ^phox) e Rac a um flavocytochrome ligada à membrana (composto de um ^phox gp91 e p22 ^phox heterodímero). Perdafunção de mutações em qualquer um destes componentes resultado NADPH oxidase na CGD. Semelhante ao dos pacientes com CGD, gp91 ^phox camundongos deficientes e P47 ^phox camundongos deficientes têm defeito oxidase de fagócitos NADPH e de acolhimento prejudicada defesa ^{13, 14.} Além de fagócitos, que contêm os componentes da NADPH oxidase descritos acima, uma variedade de outros tipos de células expressam diferentes isoformas da NADPH-oxidase.

Aqui, descrevemos um método para quantificar a produção de ROS em camundongos vivos e delinear a contribuição da NADPH oxidase para a geração de ROS em modelos de inflamação e lesão. Este método baseia-se ROS reagir com L-012 (um análogo do luminol) para emitir luminescência que é gravada por um dispositivo de carga acoplada (CCD). Na descrição original da sonda L-012, L-012-dependente de quimioluminescência foi completamente abolido pela superóxido-dismutase, o que indica que o principal ROS detectado nesta reacção foi superanião óxido ^15. Estudos subsequentes têm mostrado que o L-012 pode detectar outros radicais livres, incluindo as espécies reactivas de azoto ^{16, 17.} Kielland et al. ¹⁷ mostrou que a aplicação tópica de acetato de miristato de forbol, um activador potente da NADPH-oxidase, levou a NADPH oxidase-dependente de geração de ROS, que pode ser detectada em ratos usando o teste luminescente L-012. Neste modelo, eles mostraram que a luminescência L-012-dependente foi abolida em p47 ^phox camundongos deficientes.

Nós comparamos geração de ROS em ratinhos de tipo selvagem e da NADPH-oxidase deficiente ^{phox p47-/ – 2} ratos nos três seguintes modelos: administração 1) intratraqueal de zimosan, uma célula pro-inflamatório fúngico parede derivado do produto que podem activar a NADPH oxidase, 2) ligadura e perfuração cecal (CLP), um modelo de sepse intra-abdominal com inflamação pulmonar aguda e lesão secundária e 3) tetracloreto de carbono por via oral(CCl _4), um modelo de ROS-dependente lesão hepática. Estes modelos foram seleccionados para avaliar especificamente NADPH oxidase-dependente de geração de ROS no contexto de inflamação não infecciosa, sepse polimicrobiana e toxina induzida por lesão de órgãos, respectivamente. Comparando bioluminescência em camundongos de tipo selvagem de p47 ^{phox-/ –} ratos nos permite delinear a contribuição específica de ROS gerado pelo p47 oxidase ^phox contendo NADPH para o sinal bioluminescente nesses modelos.

Resultados de imagem de bioluminescência que demonstraram níveis elevados de ROS em ratinhos de tipo selvagem em comparação com p47 ^{phox-/ –} ratos indicaram que a NADPH oxidase é a principal fonte de produção de ROS em resposta a estímulos inflamatórios. Este método oferece uma abordagem minimamente invasiva para "real-time" monitoramento da geração de ROS durante a inflamação in vivo.

Protocol

1. Modelos Animais Ratos: Use p47 phox-/ – ratos e camundongos idade e sexo pareados C57BL6/DBA. Obter aprovação para as experiências de Animal Care Institucional e Comitê de uso. Anestesia: Use um sistema de administração contínua isoflurano para induzir a anestesia. O sistema de vaporizador (VetEquip) é preenchido com isoflurano (2-3%). Confirmar que os ratos são totalmente anestesiado pela observação da respiração, movimento e reflexo da córnea em resposta a est?…

Discussion

"Em tempo real" de medição de espécies reactivas de oxigénio (ROS) em animais vivos pode ser conseguido através da utilização de sondas fluorescentes e quimioluminescentes. Enquanto sondas fluorescentes com fracos sofrem de sinal-para-ruído ^12, a técnica de imagem descrito é mais sensível para a detecção de emissão de luz na sequência de uma reacção química de ROS com o substrato luminol baseada em L-012. Como todas as técnicas de imagiologia bioluminescentes, esta metodologia é …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
L-012	Wako Chemicals USA, Inc.	120-04891
Zymosan	Sigma, St. Louis, MO	Z4250
carbon tetrachloride	Sigma, St. Louis, MO	289116