Bioluminescens Avbildning av NADPH-oxidas aktivitet i olika djurmodeller
Summary
NADPH-oxidas är den huvudsakliga källan för reaktiva syrespecies (ROS) i fagocyter. På grund av den kortlivade karaktär ROS, är det svårt att mäta och övervaka ROS nivåer i levande djur. En minimalinvasiv metod för seriell kvantifiering av ROS i levande möss beskrivs.
Abstract
NADPH-oxidas är en kritisk enzym som medierar antibakteriella och svampdödande värdförsvar. Utöver sin roll i antimikrobiella värdförsvar har NADPH-oxidas kritiska signalfunktioner som modulerar den inflammatoriska responsen 1. Således är utvecklingen av en metod för att mäta i "realtid" kinetiken för NADPH-oxidas-derived ROS generation förväntas vara ett värdefullt forskningsverktyg för att förstå mekanismerna som är relevanta för värd försvar, inflammation och skador.
Kronisk granulomatös sjukdom (CGD) är en ärftlig sjukdom i NADPH-oxidas kännetecknas av svåra infektioner och överdriven inflammation. Aktivering av fagocyt NADPH-oxidas kräver translokation av dess cytosoliska subenheter (P47 phOx, P67 phOx, och p40 phOx) och Rac till en membranbunden flavocytochrome (bestående av en gp91 phOx och P22 phOx heterodimer). Förlustav funktion mutationer i någon av dessa NADPH-oxidas komponenter resulterar i CGD. Liknar patienter med CGD gp91 phOx-deficienta möss och P47 phOx-deficienta möss har defekt fagocyt aktivitet NADPH-oxidas och försämrad värdförsvar 13, 14. Förutom fagocyter, som innehåller NADPH-oxidas ovan beskrivna komponenterna, en mängd andra celltyper uttrycker olika isoformer av NADPH-oxidas.
Här beskriver vi en metod för att kvantifiera ROS-produktionen i levande möss och att beskriva bidraget av NADPH-oxidas till ROS generation modeller för inflammation och skada. Denna metod är baserad på ROS reagera med L-012 (en analog av luminol) att emittera luminescens som registreras av en laddningskopplad anordning (CCD). I den ursprungliga beskrivningen av L-012 sond, jag var-012-beroende kemiluminescens helt avskaffas genom superoxiddismutas, vilket indikerar att den huvudsakliga ROS detekteras i denna reaktion var superoxid anjon 15. Efterföljande studier har visat att L-012 kan detektera andra fria radikaler, inklusive reaktiva kväve arter 16, 17. Kielland et al. 17 visade att topisk applicering av forbolmyristatacetat, en potent aktivator av NADPH-oxidas, ledde till NADPH-oxidas-beroende ROS generation som kunde detekteras i möss med användning av luminescerande sond L-012. I denna modell visade de att L-012-beroende luminiscens avskaffades P47 phOx-brist möss.
Vi jämförde ROS generation i vildtyp möss och NADPH-oxidas-brist P47 phOx-/ – möss 2 i följande tre modeller: 1) intratrakeal administrering av zymosan, en pro-inflammatorisk svampens cellvägg som härrör produkt som kan aktivera NADPH-oxidas, 2) cecal ligering och punktering (CLP), en modell för intraabdominell sepsis med sekundär akut lunginflammation och skador, och 3) muntlig koltetraklorid(CCl 4), en modell av ROS-beroende leverskada. Dessa modeller var särskilt valts för att utvärdera NADPH-oxidas-beroende ROS generation i samband med icke-infektiös inflammation, polymikrobiella sepsis och toxin-inducerad organskada, respektive. Jämföra bioluminiscens i vildtyp möss P47 phOx-/ – möss kan vi beskriva specifika medverkan i ROS genereras av P47 phOx innehållande NADPH-oxidas till bioluminescent signalen i dessa modeller.
Bioluminescens imaging resultat som visade ökad ROS nivåer i vildtyp möss jämfört med P47 phOx-/ – möss indikerade att NADPH-oxidas är den huvudsakliga källan av ROS generering som svar på inflammatoriska stimuli. Denna metod ger en minimalinvasiv metod för "realtid" övervakning av ROS generation under inflammation in vivo.
Protocol
Discussion
"Realtid" mätning av reaktiva syrespecies (ROS) i levande djur kan uppnås genom att använda fluorescerande och kemiluminescerande prober. Medan fluorescerande prober lider ha svaga signal-till-brusförhållanden 12, är bildteknik beskrivs mer känslig för detektion av ljusemission efter en kemisk reaktion av ROS med luminol-baserade substrat L-012. Liksom alla bioluminescerande avbildningstekniker, är denna metod begränsad av våglängdsberoende Ijusabsorption och spridning av organ och vävn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av NIH RO1 AI079253 och Department of Veterans Affairs.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
References
- Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631 (2010).
- Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
- Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
- Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
- Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
- Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
- Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
- Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
- Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, 52-57 .
- Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
- Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
- Aramaki, Y., Y, ., Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
- Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
- Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
