Een vloeibare fase Affiniteit Capture test met behulp van magnetische korrels aan eiwit-eiwit interactie te bestuderen: het poliovirus-Nanobody Voorbeeld
Summary
In dit artikel wordt een eenvoudige, kwantitatieve, vloeibare fase affiniteit capture assay gepresenteerd. Het is een betrouwbare techniek op de interactie tussen het magnetische kralen en gemerkte eiwitten (bijv. nanobodies) enerzijds en de affiniteit tussen het gemerkte eiwit en een tweede, gemerkt eiwit (bijv. poliovirus) anderzijds.
Abstract
In dit artikel wordt een eenvoudige, kwantitatieve, vloeibare fase affiniteit capture assay gepresenteerd. Op voorwaarde dat een eiwit kan worden gelabeld en een ander eiwit gelabeld, kan deze methode worden toegepast voor het onderzoek van eiwit-eiwit interacties. Het is gebaseerd op enerzijds op het inzicht gemerkte eiwit door kobalt beklede magnetische kralen en anderzijds op de interactie tussen het gelabelde eiwit en een tweede specifieke eiwit dat wordt aangeduid. Eerst worden de etiketten en gemerkte eiwitten gemengd en geïncubeerd bij kamertemperatuur. De magnetische kralen, dat het label herkennen toegevoegd en de gebonden fractie van gemerkt eiwit wordt gescheiden van de ongebonden fractie met magneten. De hoeveelheid gemerkte eiwitten die opgenomen kan worden bepaald op indirecte wijze door meting van het signaal van de gemerkte eiwitten bleven in de ongebonden fractie. De beschreven vloeibare fase affiniteit test is zeer nuttig wanneer conformationele conversie gevoelige eiwitten zijn kontAyed. De ontwikkeling en toepassing van de test is aangetoond voor de interactie tussen poliovirus en het poliovirus herkennen van nanobodies 1. Aangezien poliovirus gevoelig conformationele conversie 2 wanneer gehecht aan een vaste ondergrond (ongepubliceerde resultaten), is het gebruik van ELISA beperkt en een vloeistoffase systeem derhalve de voorkeur. Een voorbeeld van een vloeibare fase systeem vaak gebruikt in polioresearch 3,4 de micro proteïne-A-immunoprecipitatie test 5. Hoewel deze test heeft bewezen de toepasbaarheid, het vereist een Fc-structuur, die afwezig is in de nanobodies 6,7. Echter, zoals een andere mogelijkheid, kunnen deze interessante en stabiele enkel-domein antilichamen 8 gemakkelijk worden gemanipuleerd met verschillende tags. De gebruikte (His) 6-tag affiniteit voor tweewaardige ionen zoals nikkel of kobalt, die gemakkelijk op hun beurt worden aangebracht op magnetische korrels toont. Hiervoor werden deze eenvoudige kwantitatieveaffiniteit capture assay op basis van kobalt gecoate magnetische kralen. Poliovirus werd gelabeld met 35 S om ongehinderd interactie met de Nanobodies mogelijk te maken en een kwantitatieve detectie mogelijk. De methode is eenvoudig uit te voeren en kunnen worden tegen lage kosten, die verder wordt ondersteund door de mogelijkheid effectief regenereren van de magnetische korrels.
Protocol
Discussion
In het protocol wordt de radioactiviteit van het antigeen interactie met de nanobody gedefinieerd als het verlies van radiogelabelde virus uit de supernatant. Daarom is de hoeveelheid neergeslagen radioactiviteit (= 100 – a%) (gebonden aan de magnetische korrels) worden geschat op een indirecte wijze de radioactiviteit in het supernatant (= a%). Anderzijds is het ook mogelijk om de radioactiviteit van het neergeslagen gebonden fractie van antigen te meten op directe wijze door elutie de immunocomplexen van de magnetisch…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken de medewerkers van de afdeling Farmaceutische Biotechnologie en Moleculaire Biologie en in het bijzonder Monique De Pelsmacker voor de voorbereiding van de radioactief gemerkte virus. We zijn dankbaar voor Ellen Merckx en Hadewych Halewyck voor hun interessante opmerkingen en discussies en aan Gerrit De Bleeser voor zijn hulp in het lab. Dit werk werd financieel ondersteund door een OZR toekenning van de Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) en de World Health Organization (TSA 200.410.791). Lise Schotte is een predoctorale fellow van het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ‘HiSafe’ 2 | Perkin Elmer | 1200 – 436 | Scintillation fluid |
References
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. . The Immunoassay Handbook. , (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
