Het vervaardigen van een dubbellagige Hydrogel om ASC differentiatie Controle
Summary
Dit protocol richt zich op gebruik te maken van de inherente vermogen van stamcellen om cue te nemen van hun omringende extracellulaire matrix en worden aangezet om te differentieren naar verschillende fenotypes. Deze methode manuscript strekt de beschrijving en karakterisering van een model met behulp van een dubbellagige hydrogel, bestaande uit PEG-fibrine en collageen, gelijktijdig gelijktijdig onderscheid vet-stamcellen<sup> 1</sup>.
Abstract
Natuurlijke polymeren door de jaren heen hebben meer belang, omdat van hun gastheer biocompatibiliteit en het vermogen om samen te werken met cellen in vitro en in vivo. Een gebied van onderzoek die belofte houdt in de regeneratieve geneeskunde is de combinatorische gebruik van nieuwe biomaterialen en stamcellen. Een fundamentele strategie op het gebied van tissue engineering is het gebruik van drie-dimensionale steiger (bijvoorbeeld gedecellulariseerde extracellulaire matrix, hydrogels, micro / nano deeltjes) voor de aansturing van de celfunctie. Deze technologie heeft zich ontwikkeld uit de ontdekking dat cellen een substraat waarop ze kunnen zich nodig hebben, vermenigvuldigen, en uiten hun gedifferentieerde cellulaire fenotype en functie 2-3. Meer recent heeft ook vastgesteld dat de cellen niet alleen deze substraten te gebruiken voor de naleving, maar ook interactie en neem signalen uit de matrix substraat (bijvoorbeeld, extracellulaire matrix, ECM) 4. Daarom werden de cellen en steigers een wederzijdse verbinding diedient om te controleren weefsel ontwikkeling, organisatie, en de uiteindelijke functie. Vet-afgeleide stamcellen (ASC) mesenchymale zijn, niet-hematopoëtische stamcellen aanwezig in vetweefsel dat multi-lijn differentiatie kan vertonen en dienen als een gemakkelijk toegankelijke bron van cellen (dat wil zeggen pre-vasculaire endotheel en pericyten). Onze hypothese is dat het vet-afgeleide stamcellen kunnen worden gericht op verschillende fenotypes tegelijk door gewoon co-kweken ze in dubbellagige matrices 1. Ons laboratorium is gericht op dermale wondgenezing. Daartoe hebben we een samengestelde matrix van natuurlijke biomaterialen fibrine, collageen en chitosan kunnen nabootsen die de eigenschappen en functies van de dermale specifieke wondgenezing ECM omgeving.
Protocol
Discussion
ASC's zijn bekend om hun gemak van isolatie en het vermogen om onderscheid te maken in de richting van verschillende celtypes. Met de technieken beschreven in dit manuscript zijn wij in staat om de plasticiteit van ASC te benutten door het blootstellen van deze cellen om meerdere biomatrices tegelijk. Als cellen weg te migreren van hun CSM basis en voeren hun omringende extracellulaire omgeving, de cellen nemen richtsnoer van het schavot en kan zowel stand te houden "stemness" (collageen) of worden aangeze…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SN werd ondersteund door een Postdoctoraal Fellowship Grant van de Pittsburgh Tissue Engineering Initiative. DOZ wordt ondersteund door een subsidie van The Genève Foundation.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Consumable |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C8106 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-Oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) | Molecular probes | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Fibrinogen | Sigma | F3879 | Consumable |
| Thrombin | Sigma | T6884 | Consumable |
| Benztriazole Derivative of Polyethylene | Sunbio | DE-034GS | Consumable |
| Tris Buffer Tablet (pH 7.6) | Sigma | T5030 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Scientific | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | – | – | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman | Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss MicroImaging | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
References
- Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
- Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
- Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. , (2008).
- Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).
- Bubnis, W. A., Ofner, M. C. The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
- Zhang, G. A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery. Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
- Zhang, G. Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix. Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).
- Rochon, M. H. Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries. Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
