Le façonnage d'une bicouche Hydrogel de contrôler la différenciation ASC

Summary

Ce protocole met l'accent sur l'utilisation de la capacité inhérente de cellules souches de prendre exemple sur leur matrice extracellulaire environnante et être amené à se différencier en de multiples phénotypes. Ce manuscrit méthodes étend notre description et la caractérisation d'un modèle utilisant un hydrogel bicouche, composé de PEG-fibrine et le collagène, à la fois co-différencier les cellules souches adipeuses¹.

Abstract

Les polymères naturels au fil des ans ont acquis plus d'importance en raison de leur biocompatibilité hôte et sa capacité à interagir avec les cellules in vitro et de vivo. Un domaine de recherche prometteur dans la médecine régénérative est l'utilisation combinatoire de nouveaux biomatériaux et des cellules souches. Une stratégie fondamentale dans le domaine de l'ingénierie tissulaire est l'utilisation de échafaudage tridimensionnel (par exemple, décellularisée matrice extracellulaire, les hydrogels, les micro / nano particules) pour diriger la fonction des cellules. Cette technologie a évolué à partir de la découverte que les cellules ont besoin d'un substrat sur ​​lequel ils peuvent adhérer, prolifèrent, et d'exprimer leur phénotype différencié et la fonction cellulaires ^2-3. Plus récemment, il a également été déterminé que les cellules non seulement utiliser ces substrats pour l'adhésion, mais aussi d'interagir et de prendre des repères à partir du substrat de matrice (par exemple, la matrice extracellulaire, ECM) ^4. Par conséquent, les cellules et les échafaudages ont une connexion réciproque quesert à contrôler le développement des tissus, l'organisation, et la fonction ultime. Les cellules souches adipeuses (CSA) sont mésenchymateuse, les cellules souches hématopoïétiques non-présents dans le tissu adipeux qui peut présenter de lignées multiples différenciation et servir comme une source facilement accessible de cellules (c.-à-pré-vasculaire endothélium et péricytes). Notre hypothèse est que les cellules souches adipeuses peuvent être dirigés vers différents phénotypes simultanément par simple co-culture entre eux dans des matrices bicouches ^1. Notre laboratoire se concentre sur la cicatrisation cutanée. À cette fin, nous avons créé une matrice composite unique à partir des biomatériaux naturels, de la fibrine, de collagène, de chitosan et qui peuvent imiter les caractéristiques et les fonctions d'un cutanée spécifique cicatrisation ECM environnement.

Protocol

1. Isoler des cellules souches adipeuses (CSA) 1, 5 Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire. Isoler adipeux périrénal chez le rat et de l'épididyme et laver avec une solution stérile de Hank saline tamponnée (HBSS) contenant 1% de sérum de veau fœtal (FBS) de 5 précédemment décrit. Cette étude a été menée en conformité avec la Loi sur la protection des anima…

Discussion

ASC sont bien connus pour leur facilité d'isolement et de capacité à se différencier vers différents types cellulaires. Avec les techniques décrites dans ce manuscrit, nous sommes en mesure d'exploiter la plasticité des CSA en exposant ces cellules à biomatrices multiples simultanément. Comme les cellules migrent loin de leur base CSM et entrer dans leur environnement extracellulaire, les cellules prennent exemple sur l'échafaud, et peut soit maintenir "caractère souche" (collagène) ou …

Materials

Name of the reagent/equipment	Company	Catalogue number	Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Consumable
Collagenase Type II	Sigma-Aldrich	C6685	Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352350	Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352360	Consumable
MesenPRO Growth Medium System	Invitrogen	12746-012	Consumable
L-Glutamine	Gibco	25030	Consumable
CaCl2.2H2O	Sigma	C8106	Consumable
T75 Tissue Culture Flask	BD Biosciences	137787	Consumable
Chitosan	Sigma-Aldrich	448869	Consumable
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Consumable
N-Octanol	Acros Organics	150630025	Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate	Sigma-Aldrich	S6760	Consumable
Potassium Hydroxide	Sigma-Aldrich	P1767	Consumable
Acetone	Fisher Scientific	L-4859	Consumable
Ethanol	Sigma-Aldrich	270741	Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid	Sigma-Aldrich	P2297	Consumable
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	320331	Consumable
Ethyl Ether	Sigma-Aldrich	472-484	Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts	BD Biosciences	353097	Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes	Fisher	05-408-129	Consumable
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8779	Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655)	Molecular probes	Q2502PMP	Consumable
Type 1 Collagen	Travigen	3447-020-01	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Consumable
12-Well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	Consumable
Fibrinogen	Sigma	F3879	Consumable
Thrombin	Sigma	T6884	Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene	Sunbio	DE-034GS	Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6)	Sigma	T5030	Consumable
Centrifuge	Eppendorf	5417R	Equipment
Orbital Shaker	New Brunswick Scienctific	C24	Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2	Thermo Scientific	Model 370	Equipment
Overhead Stirrer	IKA	Visc6000	Equipment
Magnetic Stirrer	Corning	PC-210	Equipment
Vacuum Desiccator	–	–	Equipment
Particle Size Analyzer	Malvern	STP2000 Spraytec	Equipment
Water Bath	Fisher Scientific	Isotemp210	Equipment
Spectrophotometer	Beckman	Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer	Equipment
Vortex	Diagger	3030a	Equipment
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M2	Equipment
Light/Fluorescence Microscope	Olympus	IX71	Equipment
Confocal Microscope	Olympus	FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope	Equipment
Scanning Electron Microscope	Carl Zeiss MicroImaging	Leo 435 VP	Equipment
Transmission Electron Microscope	JEOL	JEOL 1230	Equipment