Ingeniería de un hidrogel de dos capas para el control de la diferenciación ASC
Summary
Este protocolo se centra en la utilización de la capacidad inherente de las células madre para tomar el ejemplo de su matriz extracelular circundante y ser inducidas a diferenciarse en múltiples fenotipos. Este manuscrito métodos extiende nuestra descripción y caracterización de un modelo utilizando un hidrogel bicapa, compuesto de PEG-fibrina y colágeno, a la vez co-diferenciar derivadas de tejido adiposo células madre<sup> 1</sup>.
Abstract
Polímeros naturales en los últimos años han adquirido mayor importancia debido a su biocompatibilidad anfitrión y capacidad de interactuar con las células de vitro e de vivo. Un área de investigación que promete en medicina regenerativa es el uso combinatorio de biomateriales novedosos y células madre. Una estrategia fundamental en el campo de la ingeniería de tejidos es el uso de andamios tridimensionales (por ejemplo, descelularizados matriz extracelular, hidrogeles, micro / nano partículas) de la dirección de la función celular. Esta tecnología ha evolucionado desde el descubrimiento de que las células necesitan un sustrato sobre el que se pueden adherir, proliferan, y expresar su fenotipo diferenciado y función celular 2-3. Más recientemente, se ha determinado también que las células no sólo utilizar estos sustratos para la adherencia, sino también interactuar y tener señales de la matriz de sustrato (por ejemplo, la matriz extracelular, ECM) 4. Por lo tanto, las células y andamios tienen una conexión recíproca quesirve para controlar el desarrollo del tejido, la organización y función última. Derivadas de tejido adiposo células madre (ASC) son mesenquimal, no las células madre hematopoyéticas presentes en el tejido adiposo que puede exhibir múltiples linaje diferenciación y sirven como una fuente disponible de células (es decir, pre-endotelio vascular y pericitos). Nuestra hipótesis es que derivadas de tejido adiposo células madre pueden ser dirigidos hacia diferentes fenotipos de forma simultánea simplemente co-cultivo en matrices de doble capa 1. Nuestro laboratorio está centrado en la curación de heridas dérmicas. Para este fin, se creó una matriz compuesta única de los biomateriales naturales, fibrina, el colágeno, y quitosano que puede imitar las características y funciones de un dermo-específica curación ambiente de la herida de ECM.
Protocol
Discussion
ASCs son bien conocidos por su facilidad de aislamiento y la capacidad de diferenciar hacia diversos tipos de células. Con las técnicas descritas en este manuscrito, que son capaces de explotar la plasticidad de la ASC mediante la exposición de estas células para biomatrices múltiples simultáneamente. Como las células migran lejos de su base de CSM y entrar en su entorno extracelular, las células toman el ejemplo de la tarima y puede mantener la "troncalidad" (colágeno) o ser inducidas a diferenciarse…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SN fue apoyado por una beca Postdoctoral Fellowship de la Iniciativa de Ingeniería de Tejidos de Pittsburgh. DOZ con el apoyo de una subvención concedida por La Fundación de Ginebra.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Consumable |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C8106 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-Oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) | Molecular probes | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Fibrinogen | Sigma | F3879 | Consumable |
| Thrombin | Sigma | T6884 | Consumable |
| Benztriazole Derivative of Polyethylene | Sunbio | DE-034GS | Consumable |
| Tris Buffer Tablet (pH 7.6) | Sigma | T5030 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Scientific | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | – | – | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman | Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss MicroImaging | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
References
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